了解 CRISPR 研究的生物学 101

彼得-琼斯（Peter Jones）博士和查里斯-希梅达（Charis Himeda）博士上周意外地发现自己成了媒体的焦点。 关于在 FSHD 细胞中应用 CRISPR 技术的论文. .为了回应公众对这一故事的兴趣，他们编写了以下 “入门指南”，以解释基本概念并澄清人们可能感到困惑的一些问题。.

细胞生物学

最简单明了的版本是 基因组 由细胞中的所有 DNA 组成，以染色体的形式存在。. 基因 是编码 核糖核酸, ，其代码为 蛋白. .当 RNA 和蛋白质从一个基因中积极产生时，该基因被称为 表示 (开 “或 ”活跃“）。一般来说，蛋白质是运行细胞的机器。这种机器有些是所有类型细胞共有的（每个细胞都需要的），有些则是特定类型细胞专用的（某些蛋白质能让细胞发挥肌肉细胞的功能，而不是血细胞或肝细胞）。.

前列腺增生症遗传学背景

人类基因组约有一半由正常情况下被抑制的重复DNA序列组成（统称为 “重复基因组”）。前列腺增生症的疾病基因座就在重复基因组中，位于一个名为D4Z4的大型重复序列上。D4Z4 重复基因在几条不同的染色体上有数百个拷贝。前列腺增生症是由 4 号染色体上特定类型的 D4Z4 重复序列缩短（少于 10 个拷贝）引起的。这种缩短会导致该区域失去抑制作用，从而使 DUX4 基因（藏于 D4Z4 的每个拷贝中，在体细胞中通常保持沉默）从单个致病重复单元（阵列的最后一个单元）启动。骨骼肌中 DUX4 的异常表达会导致前列腺肥大症。.

CRISPR/Cas9 的背景

CRISPR/Cas9 是一种基因编辑技术，包括两个关键部分：

1. 细菌中的 Cas9 蛋白和
2. 一种引导 RNA，可将 Cas9 靶向基因组内的特定序列。.

正常的 Cas9（最常用的版本）是一种切割 DNA 的酶，可以将改变或新的 DNA 序列插入基因组的特定位置（因此，“基因编辑技术 ”一词与典型的 CRISPR/Cas9 方法有关）。我们使用了一种与另一种蛋白质（KRAB）融合的非切割型 Cas9（“死 Cas9 ”或 dCas9），后者的正常功能是关闭基因表达。原则上，dCas9-KRAB 可以靶向并特异性地抑制任何靶基因的表达。.

CRISPR在FSHD与其他疾病中的应用

大多数疾病都是由于单个编码蛋白质的基因发生突变，导致产生功能失调的蛋白质或根本没有蛋白质。因此，研究这些 “典型 ”疾病的研究人员使用 Cas9 切除疾病基因的突变部分，用正确的 DNA 序列取而代之。对于前列腺增生症，我们不需要替换缺失/功能失调的蛋白质；相反，我们需要阻止有毒蛋白质的产生。因此，CRISPR 抑制作用 与 dCas9-KRAB（而不是 编辑 Cas9）可能特别适用于前列腺增生症。.

我们研究的主要发现

大多数基因只有两个拷贝（父母各一个），而且非常相似；因此，从概念上讲，靶向这些序列非常简单。相比之下，D4Z4（4 号染色体特定类型上的最后一个重复单元）只有一个特定拷贝表达 DUX4，从而导致前列腺肥大症。这给基因组靶向带来了通常不会遇到的复杂性。目前还不清楚现有的CRISPR技术是否能在基因组中数百个几乎相同的序列中用于靶向D4Z4的单个致病拷贝。在这项研究中，我们发现事实上我们可以利用 dCas9-KRAB 靶向基因组的一个重复区域并抑制致病性 DUX4 基因的表达。.

通常情况下，研究人员使用 Cas9 来编辑有问题的 DNA 序列，目前也在尝试用这种方法来治疗前列腺增生症。然而，切割一个存在数百个几乎相同拷贝的重复序列对细胞来说可能非常危险，甚至是灾难性的。我们研究的一个关键点是，所有的D4Z4重复序列在正常情况下都处于关闭（未表达）状态，只有在FSHD中致病的D4Z4处于开启（表达）状态，从而导致DUX4基因的异常表达。因此，我们决定使用 dCas9-KRAB 试图将所有 D4Z4 恢复到关闭状态。已经处于关闭状态的 D4Z4 将保持关闭，而处于开启状态的 D4Z4 将切换到关闭，其中包括导致前列腺肥大症的 D4Z4。我们的研究表明，我们可以设计并利用导向 RNA 将 dCas9-KRAB 抑制剂靶向 FSHD 疾病基因座，从而有效地将 DNA 恢复到关闭状态，抑制致病 DUX4 基因的表达。.

我们的研究是

1. 首次证明利用 CRISPR 技术可以有效地靶向重复基因组；;
2. 首次使用 CRISPR 抑制作用 与CRISPR相比 编辑, 其他实验室在其他疾病研究中广泛使用）。. 备注我们没有开发 CRISPR 抑制工具（dCas9-KRAB）--它是由其他实验室开发的；;
3. 首次在原代人类肌肉细胞中使用 CRISPR 技术（与更常用的 “永生 ”细胞系相比，原代人类肌肉细胞更接近患者体内的细胞）。.

这一发现与其他预防/治疗前列腺增生症的工作有何不同？

许多研究人员正在研究如何抑制DUX4或其导致FSHD的下游通路的表达。相比之下，我们的目标是通过将 FSHD 疾病基因座的 DNA 恢复到正常的抑制状态来克服潜在的遗传缺陷。这种方法有几个优点：

1. 它应能纠正因疾病基因座失去抑制而导致的疾病，包括 DUX4 的病理表达；;
2. 它应能纠正由 DUX4 表达引起的疾病的所有方面；以及
3. 疾病基因座结构的抑制性变化有可能遗传给后代细胞。.

CRISPR 技术的特异性也是一个问题。除了结合预定的目标序列外，引导 RNA 对基因组中的类似序列也有亲和力，可以将 Cas9 切割酶招募到这些非目标位置。通过使用 dCas9，我们避免了在非预期位置切割基因组的严重问题。.

您希望会有什么结果？这是完全预防前列腺增生症的一个步骤吗？

我们相信，这项工作为将来利用CRISPR技术治疗前列腺增生症奠定了基础。基因组编辑平台正在快速发展，有望对许多疾病进行更有效、更特异的矫正。例如，目前已经成功开发出了可用于病毒递送的新型Cas9酶，这对于实现治疗至关重要。.

我们的工作表明，CRISPR系统可用于靶向和校正人类基因组中非常不寻常的部分，因此原则上这种策略对于前列腺增生症是可行的。最终，在CRISPR技术用于前列腺增生症或任何其他疾病之前，我们还需要做更多的工作，才能将其应用于临床。我们必须更好地了解基因编辑/修饰的脱靶效应和长期影响。幸运的是，任何疾病治疗的进步都是所有人的进步，因为许多疗法和技术都具有广泛的适用性，而且在疗法开发的各个阶段都能吸取经验教训。.

将 CRISPR 与当前的研究经费相结合

CRISPR 系统是在细菌中发现的，它是细菌用来保护自己免受感染的一种防御机制。这是一个很好的例子，说明这一生物系统对医学、农业等领域具有重要影响，如果没有基础研究的支持，它永远不会被发现并发展成为基因改造工具，这也凸显了增加基础研究经费的必要性。重大发现总是来自意想不到的地方。.