我们资助的研究

这项研究的重点是找出前列腺增生症的新型遗传病因。我们将通过全基因组测序（WGS）对一组 40 例 FSHD 患者进行研究，在这些患者中，我们还无法从基因上确认 FSHD。这些患者的表型与前列腺增生症一致，可能有导致前列腺增生症的其他遗传机制，这可以通过分析肌肉细胞中 DUX4 的表达来检验。事实上，在这些患者中，我们已经证实了肌肉细胞培养物中存在 DUX4，但对于所有这些患者，我们都缺乏明确的遗传学解释。我们将把 WGS 与肌肉细胞培养物中的功能研究结合起来，以确定新的候选疾病基因或疾病调节因子与 DUX4 表达之间的因果关系。我们希望这项研究能揭开骨骼肌中影响 DUX4 调节的疾病修饰因子的全貌。.

确定可靠的循环生物标志物对于诊断前列腺增生症、监测其进展和评估临床试验的治疗效果至关重要。在一个合作网络中，我们发现了一种新的 DUX4 蛋白伴侣。我们的团队最近获得的数据表明，DUX4 能诱导该蛋白过度活跃，从而产生一种特异性分子。我们的研究旨在证实这些有希望的初步数据，并建议检测 FSHD 患者血液中的这种分子和其他相关分子。因此，我们的目标是确定这些新的可测量生物标志物，并揭示与 DUX4 表达异常相关的新分子途径，最终制定新的治疗策略。.

DUX4 的表达会导致炎症和肌肉细胞死亡。人们对免疫系统如何以及为何攻击前列腺肥大症患者的肌肉知之甚少。最近的研究结果表明，骨骼肌中 DUX4 的错误表达会破坏 RNA 分子的处理和质量控制。通常情况下，RNA 分子会被称为内含子的序列片段打断，需要通过称为剪接的过程将其去除，才能作为蛋白质合成的模板。如果 RNA 的剪接不正确，就会产生有毒的截短蛋白质以及被免疫系统识别为外来的新型抗原（新抗原）。由于剪接调节蛋白质的多样性和功能，因此恢复 FSHD 患者的正常剪接机制有助于纠正错误蛋白质的生成，减轻疾病症状，包括肌肉损伤、炎症和激活的免疫反应。我们的提案旨在更好地了解DUX4诱导的剪接缺陷和新抗原生成的生物学原理，为开发除了抑制DUX4表达之外还能解决这些机制的靶向疗法铺平道路。.

患有前列腺增生症的男性通常比女性更年轻就会出现肌肉无力的症状，但造成这种差异的原因目前尚不清楚。女性性激素可能会在一定程度上保护男性前列腺增生症患者，但我们最近的研究发现，即使没有性激素，男性前列腺增生症患者的肌肉细胞也会比女性患者的肌肉细胞受到更严重的肌肉蛋白质破坏。本项目将利用一种新的小鼠模型（FLEXDUX4）进一步研究前列腺增生症的性别差异。与人类患者一样，雄性 FLExDUX4 小鼠的肌肉病变比雌性小鼠更严重。此外，我们最近还发现，雌性 FlexDUX4 小鼠对运动训练的反应比雄性更积极。.

该项目将首次全面分析 FLExDUX4 模型中的数千种肌肉蛋白质，包括运动训练对雄性和雌性动物的影响。我们希望我们的工作能让人们更好地了解前列腺增生症的性别差异，从而开发出新的疗法，例如针对男性或女性特有的前列腺增生症过程进行治疗。此外，当我们发表工作成果时，我们将免费公开我们的原始数据，以造福前列腺增生症研究界。.

由于 DUX4 具有高度灵活性，因此通过标准结构生物学方法获得 DUX4 与其他蛋白质相互作用的全原子结构具有挑战性。我们之前开发了一种实验/计算相结合的工作流程，利用了深度学习算法的最新进展，并成功获得了两种 DUX4 相互作用的结构。.

我们建议采用相同的工作流程来阐明两种关键相互作用的结构基础：DUX4-P300 和 DUX4-SIX1。P300 与 DUX4 的相互作用是基因失调和细胞毒性的第一步。SIX1 是肌生成的调节因子，它与 DUX4 的相互作用可能会破坏其正常功能。因此，成功完成这项提案将为关键的相互作用提供坚实的全原子结构基础，从而推进我们对 DUX4 早期毒性的理解。这种结构是随后合理设计旨在破坏这些相互作用的小分子和多肽疗法的绝对必要条件。.

面岬肱肌营养不良症（FSHD）是最常见的进行性肌营养不良症，儿童和成人均可患病，不分性别。不幸的是，尽管患者的预期寿命没有改变，但他们最终还是需要坐轮椅，而且目前还没有治愈或治疗方法。FSHD领域的共识是，转录因子DUX4的异常再激活是导致该病的主要原因。鉴于 DUX4 在前列腺增生症中的关键作用，用小分子药物阻断 DUX4 的表达是一种有吸引力的解决方案。.

在我们的研究中，我们发现了一种新型的 DUX4 表达调节剂，当阻断这种调节剂时，DUX4 的表达会显著减少，其毒性效应也会降低。有趣的是，这种新型 DUX4 调节因子的几种药物抑制剂已经上市，目前正在进行其他疾病的临床试验，这对开发 FSHD 的治疗策略具有很大的优势。由于初步数据前景看好，我们建议使用这些小分子抑制剂，并在 FSHD 的相关模型中测试其安全性和有效性。.

该项目将使我们能够研究抑制 DUX4 的毒性表达作为治疗前列腺增生症的创新疗法的潜力。.

肌肉萎缩症（MD）的一个共同点是肌纤维（肌纤维）的慢性死亡。细胞有两种可能的死亡方式，由其死亡形态决定：一是爆炸死亡，细胞内容物释放到外膜之外（即坏死）；二是主动自我降解/消化（细胞凋亡）死亡。从历史上看，研究人员认为细胞坏死是一个由严重损伤（冷冻、创伤等）引起的意外过程，无法控制或预防。相反，人们认为细胞凋亡是唯一可控的细胞死亡过程。最近，随着一种被称为 “necroptosis ”的基因编程形式坏死的发现，这种教条失效了。.

原来，最近在阿尔茨海默氏症或帕金森氏症等几种退行性疾病中发现了坏死蛋白酶。使用特定的坏死抑制剂的临床试验已经启动。.

2018 年，我们是第一个发现肌肉组织中会发生坏死的实验室，并确定了坏死在 DMD 中的作用。2021 年，我们在前列腺增生症中也发现了坏死。.

我们最近开始用一种特异性坏死阻断剂治疗 DMD 大鼠，结果令人鼓舞。我们希望将新的治疗策略推广到前列腺增生症，并对前列腺增生症小鼠进行坏死阻断治疗。

前列腺增生症协会发起了一项循环生物标志物研究，旨在利用现有的生物测定方法测量患者血液中DUX4调控靶基因的数量。 目前已经设计了几项实验，在细胞培养实验中测量DUX4调控基因的蛋白质产物，并确认其水平是否受DUX4表达水平的调节。如果实验成功，将对FSHD患者和未受影响的志愿者血液样本进行检测，以确定是否能检测出两组之间的差异，以及血液检测是否能替代更常见的针刺活检。 这些研究将与科罗拉多州丹佛市科罗拉多大学安舒茨医学中心的 Amy Campbell 博士和 Sujatha Jagannathan 博士合作进行；罗切斯特大学医学中心的 Rabi Tawil 博士将提供患者和未受影响志愿者患者的血液样本，蛋白质组检测服务提供商 Olink 将提供定量蛋白质组服务。 这些研究的总概算为 $32,892 美元。.

本研究旨在评估前列腺增生症患者吞咽困难、肠道症状和泌尿系统症状的发生率。研究方法：我们向前列腺增生症协会邮件列表发送匿名在线调查问卷，询问患者和家庭控制人员有关吞咽困难、肠道症状和泌尿系统症状的情况，包括其发生频率、严重程度和对生活质量的影响，以及治疗这些症状所需的药物（如果有的话）。至今已有 740 名参与者完成了问卷调查。结果：我们将利用收集到的数据确定相关症状在前列腺增生症患者中是否更普遍，如果是，这些症状对生活质量的影响程度如何。这些结果可能有助于指导我们确定是否有必要进一步调查前列腺增生症患者出现这些症状的原因和/或治疗方法。.

FSHD 协会向罗切斯特大学医学中心提供 $24,310 美元的资助，用于购买一台超低温冷冻机和使用实验室信息管理系统 (LIMS)，以支持和维护 FSHD 临床路径研究网络 (CTRN) 组织生物库的扩展。该生物库将成为开展探索性生物标记物研究以及未来相关验证工作的重要资产。.

FSHD最常见的症状之一是面部肌肉无力。面部肌肉无力限制了面部表情，许多患者称这是主要的致残症状，因为它妨碍了他们的非语言交流。尽管面部肌肉无力在前列腺增生症中很常见，也很重要，但人们对其进展和后果却缺乏深入了解。这主要是因为直到最近，还没有足够的测量工具来测量面部无力。在这项研究中，我们使用了四种新开发的测量工具来评估面部无力随时间的变化情况。这些工具包括由医生对面部无力程度进行的评分、对面部无力程度进行分级的自动视频系统、对肌肉组织进行评估的超声波以及由患者报告的功能后果问卷。对大约 100 名 FSHD 患者进行了长达五年的随访。这项研究收集的纵向数据将揭示面部肌肉受累的模式、随时间推移的进展情况以及肌肉无力与症状负担的关系。这些知识可用于改善临床上对患者的咨询，并有助于开发和测试治疗面部肌肉无力的疗法。.

DUX4 属于一类被称为转录因子的基因。这些基因就像开关一样，告诉细胞何时需要打开或关闭其他基因。在早期胚胎发育过程中，DUX4 通常起着开启基因的作用，但当它在成年肌肉中开启时，就会变得有毒，导致肌肉纤维随着时间的推移而死亡。虽然我们知道 DUX4 所开启基因的身份，但不知道其中哪些基因会导致毒性。这一信息至关重要，因为它能让我们设计出新的分子疗法。在这里，我们将通过比较 DUX4 激活的基因和其他相关转录因子激活的基因，来研究哪些基因会导致毒性。例如，其他 DUX 家族基因与 DUX4 相似，也可能激活类似的基因集，但它们没有毒性。通过比较它们与 DUX4 激活的基因集，我们可以列出一份潜在毒性基因的清单。我们将确定由这些因子和其他因子激活的基因集，并利用它们找到 DUX4 激活的有毒基因。然后，我们将设计分子工具来抑制这些有毒基因，并评估它们在临床上的应用潜力。.

目前，学术界和生物制药领域的许多实验室都在开发治疗前列腺增生症的疗法，这些疗法很有可能成功减缓甚至阻止疾病的发展。问题是如何准确评估每种疗法，挑选出最有希望进一步研究的一两种疗法。要做到这一点，最好的办法是使用 “生物标志物”，通常是一种在疾病暴发时含量增加，而在疾病静止或接受有效治疗时含量减少的分子。理想情况下，生物标志物分子应该可以在血清或尿液中找到，这样病人在需要检测时就不会感到不适。我们发现，FSHD患者体内因DUX4程序而增加的一种名为SLC34A2的蛋白质具有FSHD生物标志物的许多特性。在此，我们建议对其作为生物标记物的潜在用途进行评估，希望它最终能在临床试验中发挥作用。我们建立的方法应该也适用于其他潜在的生物标记物。.

在 FSHD 的治疗方法中，我们开发了反义寡核苷酸 (ASO)，它能与 DUX4 信使 RNA 结合，阻止产生有毒的 DUX4 蛋白。然而，目前使用反义寡核苷酸治疗肌病受到了限制，因为注射后，反义寡核苷酸会被肝脏和肾脏迅速从血液中清除，即使到达其他组织，也不会优先进入肌肉。我们的总体目标是将这些 ASO 保护到纳米颗粒中，并将其与一种分子连接起来，以便在注射到血液中后将 ASO 直接输送到肌肉细胞中。我们之前已经确定了 5 种短蛋白片段（肽），与非肌肉细胞相比，它们能优先进入肌肉，因此被称为肌肉特异性肽（MSPep）。在此，我们想确定将 MSPep 与 ASO 连接是否能改善其在血液中的运输和肌肉吸收，从而有效减少有毒的 DUX4 蛋白。我们的项目将在细胞培养和小鼠模型中确定：#1 MSPep-ASO 的肌肉吸收、细胞进入途径和体内分布；#2 ASO 是否能从肌肉细胞内的 MSPep-ASO 中释放出来；#3 它是否能有效减少肌肉中毒性 DUX4 的表达。.

面岬肱肌营养不良症（FSHD）是由骨骼肌中的毒性 DUX4 基因突变引起的，它会导致肌肉变性。人们对开启 DUX4 基因的细胞机制知之甚少。更详细地描述 DUX4 基因是如何开启的，对于确定抑制 FSHD 中 DUX4 的药物靶点至关重要。Fran Sverdrup博士的研究小组和Fulcrum Therapeutics公司的发现表明，p38 MAP激酶是DUX4表达的关键驱动因素，这不仅揭示了一个治疗机会（p38抑制剂losmapimod）。抑制p38-MAPK能有效抑制FSHD细胞和动物模型中肌毒性DUX的表达，为p38抑制剂losmapimod在FSHD患者中的临床评估铺平了道路。我们建议利用这一发现来确定开启 DUX4 的调控因子，并确定在肌肉分化过程中 p38 依赖和独立信号如何与 DUX4 的表达相关联。.

我们的研究小组研究一种名为 SMCHD1 的蛋白质，它能够使基因处于 ‘睡眠 ’或沉默状态。研究表明，FSHD患者的SMCHD1基因会发生变异，导致其功能失常。这将导致毒性 DUX4 基因不适当地 ‘苏醒 ’或激活，从而导致肌肉细胞死亡以及 FSHD 患者所经历的相关肌肉萎缩和虚弱。 在这个项目中，我将研究目前未知的 SMCHD1 蛋白的三维结构和功能。通过这项研究，我们可以揭示 SMCHD1 发挥正常功能的机理细节，并了解 FSHD 相关蛋白变异如何直接改变其活性。首先，我将采用最先进的显微镜技术，直接观察SMCHD1蛋白。其次，我将使用实时成像方法来监测和比较健康和受FSHD影响的SMCHD1蛋白的行为。 我们预计，通过揭示与FSHD相关的SMCHD1功能变化，我们可以了解如何操纵该蛋白的活性，使其更有效地抑制导致FSHD的有毒DUX4基因。.

当实验室中培育的健康肌肉细胞被迫制造导致前列腺增生症的蛋白质DUX4时，它们就会灾难性地死亡。在DUX4表达的早期，细胞中防止缺陷蛋白质从异常信使核糖核酸分子中产生的重要质量控制途径失效了。结果，两件事发生了。其一，DUX4 mRNA（该质控途径的天然靶标）被放大。其二，细胞中的其他异常 mRNA 变得稳定，使细胞中充斥着有毒蛋白质。这两种后果都可能在前列腺增生症的发病机制中发挥重要作用。在本提案中，我们试图确定 DUX4 表达后 RNA 质量控制途径失效的机制，目的是挽救其活性，作为 FSHD 的治疗干预措施。.

FSHD患者会出现进行性肌肉无力和萎缩。虽然病因是有毒蛋白质 DUX4 的产生，但目前还不清楚 DUX4 是如何导致肌肉疾病的。最近的研究表明，FSHD 患者的新陈代谢功能受损，这种情况被称为代谢压力。线粒体是细胞内的能量工厂，对肌肉工作提供能量至关重要。当线粒体无法有效运作时，肌肉就会出现能量危机并退化。我们发现，DUX4 改变了线粒体的工作方式，使它们开始产生自由基--一种体积小但活性高的分子。自由基会干扰肌肉的新陈代谢，导致肌肉受损，尤其是当它们干扰肌肉使用氧气的方式时。这就改变了前列腺增生症肌肉对低氧的反应（如运动时自然出现的低氧）。我们的初步研究表明，专门针对线粒体产生的自由基的抗氧化剂可以恢复 FSHD 肌肉细胞的功能。我们将对作用于特定自由基控制的细胞系统的食品补充剂/药物进行测试，以找到能够缓解前列腺肥大症的新疗法。因此，我们对前列腺增生症肌肉代谢的研究既能拓宽我们对DUX4如何导致前列腺增生症的认识，又能确定新的疗法来补充旨在降低DUX4水平的更多实验性疗法。.

虽然转录因子DUX4的异常表达被认为是导致前列腺增生症的原因，但人们对前列腺增生症骨骼肌中DUX4表达的因素仍然知之甚少。以往的研究表明，细胞应激可刺激 DUX4 的表达，并导致 FSHD 肌肉病理的发生或发展。肌肉膜损伤是肌肉收缩过程中产生的一种重复性和常规性细胞应激形式。这种膜损伤的快速修复对肌肉健康至关重要，而膜修复的缺陷会导致其他常见肌肉萎缩症的进展。最近，我们在 FSHD 人类肌肉细胞和 FSHD 转基因小鼠模型的肌肉纤维中发现了膜修复缺陷。此外，我们还发现了细胞膜损伤可触发 DUX4 表达的初步证据。在本提案中，我们旨在研究细胞膜损伤如何促进改变影响基因表达的调控元件的组织和行为，以应对 FSHD 和健康细胞中的损伤。这项研究将有助于阐明质膜损伤在骨骼肌FSHD病理生理学中的潜在作用，并可能确定新的治疗靶点，以改善膜修复或减轻DUX4的表达。.

目前，前列腺增生症的治疗方案非常有限，这在很大程度上是由于人们对疾病机制和药物分子靶点缺乏了解。我们最近发现，前列腺肥大症患者的肌肉细胞中触发的特定代谢反应最终导致了他们的死亡。现在，我们希望开展进一步研究，评估这些代谢变化是否能在各种细胞模型和动物组织中预测FSHD的病理变化，并测试针对这种反应的现有药物化合物，以作为治疗FSHD患者的一类新化合物。(注：Angela Lek 已于 2021 年秋季离开耶鲁大学；该项目的首席研究员现为 Monkol Lek 博士）。

前列腺增生症是由肌肉中的 DUX4 基因开启引起的。DUX4 基因的产物对肌肉细胞具有毒性，随着时间的推移，损伤会不断累积，从而导致与前列腺肥大症相关的肌无力。因此，目前大多数FSHD治疗研究都侧重于 “关闭 ”FSHD肌肉中的DUX4基因。我们开发了一种系统，可以攻击 DUX4 信使 RNA，并在其用于产生有毒的 DUX4 蛋白之前将其破坏。我们使用的系统依赖于Cas13酶，它可以定向切割细胞中的RNA分子。我们发现，Cas13系统可以抑制FSHD患者肌肉细胞中DUX4的表达，抑制幅度超过85%。该系统还能将 FSHD 小鼠模型中 DUX4 的表达降低 50%。在这项研究中，我们正试图改进 Cas13 系统，以便在小鼠肌肉中更大程度地抑制 DUX4 的表达，并在将这种方法应用于人体之前确保其安全性。.

DUX4 基因在骨骼肌中通常受到抑制，其异常表达会导致前列腺肥大症。人类疾病的小鼠模型有助于回答有关疾病病理的问题和确定治疗途径。然而，小鼠体内没有 DUX4 基因，因此 FSHD 模型小鼠需要通过在基因组中插入 DUX4 基因来改造。含有 DUX4 基因的小鼠已经存在，但该基因并不处于人类的正常调控之下。在这项研究中，我们将利用人类 4q35 号染色体上的整个 FSHD 区域，包括 DUX4 基因及其邻近基因和自身的调控元件，生成新型 FSHD 模型小鼠，所有这些都来自于一名骨骼肌中存在 DUX4 表达和病理表型的 FSHD 患者。我们将研究 DUX4 是否在骨骼肌中异常表达，以及其表达是否会导致模仿 FSHD 患者的肌病表型。这项研究的成功完成将有助于深入了解DUX4在FSHD患者骨骼肌中的表达机制，该动物模型将用于为学术界和工业界开发和验证FSHD疗法。.

面腓骨肌营养不良症临床试验研究网络（FSHD CTRN）是美国和欧洲的一个学术研究中心联盟，这些中心在面腓骨肌营养不良症临床研究或开展神经肌肉临床试验方面都具有专长。FSHD CTRN 有助于缩小试验准备方面的差距，还提供了一个具有集中简化的监管流程、FSHD 方面具体而共同的专业知识以及随时准备开展高效、高质量临床试验的患者群体的研究机构网络。由于该联盟在前列腺增生症临床试验准备工作中的突出作用，目前正在提供额外资金，以扩大美国现有的联盟，增加四个研究机构（佛罗里达大学、德克萨斯大学西南医学中心、科罗拉多大学、斯坦福大学医学院）。这笔资金旨在确保更好地覆盖和惠及患者，并为整个网络的有效管理和协调提供更多资源。.

前列腺增生症是一种复杂的疾病，经过数十年的研究，我们才弄清其根本原因。幸运的是，我们现在知道前列腺增生症是由肌肉中的 DUX4 基因 “开启 ”引起的。这是一种异常现象，因为 DUX4 基因本应处于 “关闭 ”状态，而当 DUX4 基因开启时，它就会损害肌肉细胞。如今，出现了几种新的有望关闭 DUX4 的疗法。所有这些疗法都需要在人体中进行测试，以确保它们是有效的。对于以DUX4为靶点的疗法，了解它们是否有效的一种方法是测量FSHD肌肉中的DUX4水平。遗憾的是，目前还无法做到这一点，因为DUX4很难被检测到，也没有方法可以轻松地在肌肉中发现DUX4。我们的项目旨在测试一种新的 DUX4 检测方法。我们已经在培养皿细胞中证明了这种方法的有效性，现在我们需要证明我们可以在FSHD患者捐献的人体肌肉中发现DUX4。这是本项目的主要目标。如果成功，我们将开始应用这种方法，以便在 FSHD 治疗试验中检测 DUX4 水平。.

面岬肱肌营养不良症（FSHD）是一种最常见的进行性肌病，儿童和成人均可患病，不分性别。面岬肱肌营养不良症是由双同源染色体 4（DUX4）基因的异常增殖表达引起的，会对肌肉细胞产生毒性作用。尽管人们对 DUX4 的关键作用已达成共识，并进行了多项临床试验，但目前仍无法治愈 FSHD 患者，也没有有效的治疗方法。在我们的研究中，我们发现了一种新型的 DUX4 调节因子。以该因子为靶点可以阻断 DUX4 的表达，挽救 FSHD 患者肌肉细胞的行为。我们拟进行的研究将探讨一种新方法的概念，这种方法可能是治疗前列腺肥大症患者的一种有希望的选择。.

虽然转录因子DUX4的异常表达被认为是导致前列腺增生症的原因，但人们对哪些因素会触发前列腺增生症骨骼肌中DUX4的表达知之甚少。以前的研究表明，细胞应激可刺激 DUX4 的表达，这表明增强细胞应激的刺激因素可能在 FSHD 肌肉病理学的发生或发展过程中发挥核心作用。肌肉膜损伤是肌肉收缩过程中产生的一种重复性常规细胞应激形式。肌肉膜损伤的快速修复对肌肉健康至关重要，而肌肉膜修复的缺陷会导致其他常见肌肉萎缩症的发展。我们最近在 FSHD 人类肌肉细胞和 FSHD 转基因小鼠模型的肌肉纤维中发现了类似的膜修复缺陷。因此，本提案将验证一个假设，即质膜损伤引起的分子应激通过诱导 DUX4 的表达以及改变 FSHD 肌肉细胞中的基因表达和基因调控而加重 FSHD 的病情。这项研究将有助于阐明质膜损伤在骨骼肌FSHD病理生理学中的潜在作用，并可能确定新的治疗靶点，以改善膜修复或减轻DUX4的表达。.

前列腺增生症患者最初发现的症状可能大不相同，受影响肌肉的顺序也可能不同。同卵双胞胎经常会出现差异，其中一个受影响很严重，而另一个则没有。了解造成这些差异的原因是确定改变生活方式和特殊治疗方法的关键，这些方法可以将前列腺肥大症的严重程度降至最低。.

为了了解这种差异，我们需要根据症状出现的先后顺序将前列腺肥大症患者分为不同的组别，并进行比较，以确定保护某些患者的可调节因素。我们利用英国FSHD登记册对222名患者进行了分类，根据最先受影响的肌肉群（面部、肩部或腿部/足部）确定了4种FSHD类型。该项目是一个全球性合作项目，旨在扩展这些研究结果，整合来自意大利和美国的大型患者数据库，建立最大的FSHD患者数据集。我们将利用最先进的计算技术对该数据集进行分析，以确定 FSHD 患者亚型和导致病情较轻的可改变因素。这将准确描述前列腺增生症在个体身上的发展过程，从而更好地规划未来需求，并突出有益的生活方式改变。从中期来看，对患者亚型的分子研究将提高人们对前列腺增生症病因的认识，并为个性化治疗方法提供依据。.

利用CRISPR技术，Lek找到了分子通路，这些通路可以（在试管中）拯救FSHD肌肉细胞，使其免受DUX4基因的致命影响。她确定了模仿这种保护作用的药物，并计划在斑马鱼和小鼠 FSHD 模型中进一步测试这些药物。“她说：”我们的目标是确定并优先测试副作用最小、适合长期服药且已获得美国食品及药物管理局（FDA）批准（用于其他疾病）的化合物，以确保快速进入患者临床试验阶段。.

泛素-蛋白酶体系统（UPS）负责降解细胞中 80% 至 90% 的蛋白质，已被证明在介导肌肉萎缩方面发挥着重要作用。肌肉前体细胞中 DUX4 的表达会改变参与 UPS 的许多基因的表达。Homma 建议找出 DUX4 促进肌肉萎缩的可能机制。该项目的结果可能会揭示针对 DUX4 诱导的肌肉萎缩的治疗目标。.

琼斯实验室最近发现，表观遗传调控因子ASH1L是致病性DUX4表达的关键驱动因子，研究表明，降低ASH1L水平几乎可以消除DUX4的表达，而不会显著改变其他基因的表达。“琼斯说：”我们认为，ASH1L是一个出色的FSHD治疗靶点。实验室打算找出有希望的ASH1L活性先导抑制剂。.

与男性相比，女性前列腺增生症患者的临床症状较轻，而且无症状携带者的比例较高。孕酮是一种参与调节子宫内膜的重要女性激素。实验室发现，在各种细胞模型中，DUX4 是孕酮核受体（NR）的共抑制因子。这些结果表明，DUX4 可通过抑制黄体酮核受体的活性间接调节基因表达，这是以前未曾认识到的 DUX4 的作用。.

为堪萨斯大学医学中心神经病学系的 CTRN 项目经理提供过桥资金。项目经理将负责协调整个网络的活动和研究工作。职责包括为每个委员会创建人员名册，帮助组织和创建 CTRN 管理文件和 SOP、通用数据元素，与研究机构协调员、数据人员、监管专家互动，维护 CTRN 网站，管理正在进行的研究和新研究咨询，以及帮助协调网络层面的项目。此外，项目经理还将与 KUMC 合作，倡导患者参与招募和保留工作，吸引服务不足人群参与，并与数据办公室合作，确保 CTRN 网络研究的数据质量。为了将网络扩展到更多的美国站点，项目经理将确保扩展站点的当地资源可用性，确保每个站点坚持培训，并实现 CTRN 目标。.

这项申请的总体和长期目标是通过维护面阔肌营养不良症临床试验研究网络（CTRN），加快面阔肌营养不良症（FSHD）新疗法的开发。成功的临床试验取决于几个因素，包括：招募患者的途径和能力、对疾病自然史和导致疾病变化的主要因素的准确了解，以及对面阔肌营养不良症变化敏感的可靠结果测量。为FSHD临床试验制定合理的试验策略和验证结果指标的一个主要障碍是缺乏具有通用标准操作程序（SOP）的现有临床试验网络基础设施。为了克服这一障碍，我们建立了前列腺增生症临床试验网络：1）创建一个简化的监管/伦理监督系统；2）为收集哪些数据以及如何收集数据制定标准；3）创建一个训练有素、知识渊博的临床评估人员网络--这对临床试验绝对至关重要；4）创建一个训练有素、具有很强的患者参与、招募和保留技能的研究协调员网络；5）确保所有主要利益相关者的参与；6）为药物注册研究验证新的结果测量方法；7）培训下一代 FSHD 临床研究人员（图 1）。FSHD CTRN 不仅能帮助缩小试验准备方面的差距，还能提供一个具有集中简化的监管流程、FSHD 方面特定的共同专业知识以及随时准备开展高效、高质量临床试验的患者群体的研究机构网络。.

面颅骨营养不良症（FSHD）是一种复杂的疾病。经过数十年的研究，FSHD 研究领域目前的重点是将 DUX4 的错误表达作为该疾病的主要致病因素。DUX4 对肌肉和许多非肌肉细胞类型具有毒性。前列腺增生症的症状往往因人而异，症状的严重程度、进展速度和发病年龄也可能存在差异，甚至在有多个患病亲属的家族中也是如此。通常会出现不对称现象，即身体一侧与另一侧的肌肉无力程度不同。虽然 DUX4 具有毒性，但一些细胞和组织似乎能够抵御其破坏作用。我们推测，前列腺增生症的变异性与 DUX4 的不同毒性有关；前列腺增生症患者的细胞或肌肉中 DUX4 的毒性作用可能会减弱。然而，某些细胞可能抵御 DUX4 损伤的机制尚不清楚。在本提案中，我将研究我的假设，即天然 microRNA（在所有人类细胞中正常产生，有助于激活天然细胞基因沉默途径）可以减少 DUX4 的表达，降低其毒性，并有可能减缓前列腺增生症的进展。在目标 1 中，我将继续研究我们在有限的候选筛选中发现的单个 miRNA。这种 miRNA 能结合 DUX4 转录本，减少其翻译成 DUX4 蛋白，从而降低其在培养细胞中的毒性。这一目标为我们的第二个目标提供了一个原理证明，第二个目标的重点是确定可能靶向 DUX4 的全部天然 miRNA（迄今为止人类已知的 miRNA 有 1,881 种）。我们的理想目标是将一种或多种天然 miRNA 与前列腺增生症的疾病进展联系起来，但即使我们无法找到 miRNA 作为前列腺增生症天然调节因子的证据，我们也建议，如果这些 miRNA 能够结合并减少 DUX4，它们仍可用作潜在的治疗药物。具体来说，已知某些药物会增加特定天然microRNA的表达，因此有可能利用药物来增加DUX4靶向miRNA的表达，从而减少DUX4的表达，使其不再具有毒性。.

在大多数体细胞组织中，D4Z4重复序列具有异染色特征。因此，可能是由于重复介导的表观遗传抑制，转录因子 DUX4 在体细胞组织中不表达或很少表达。面肱骨肌营养不良症（FSHD）患者的 D4Z4 重复序列的表观遗传抑制部分失效，导致 DUX4 在部分肌肉细胞核中表达。D4Z4重复序列收缩到1-10个单位（FSHD1）或染色质修饰因子SMCHD1和DNMT3B发生杂合突变（FSHD2）都可能导致表观遗传抑制失效。这些染色质修饰因子是在体细胞中建立或维持 D4Z4 重复序列的抑制染色质结构所必需的。我们的研究小组先前产生了一种携带 2.5 个重复单位的 D4Z4 重复序列的转基因小鼠模型。这些D4Z4-2.5小鼠是FSHD1某些特征的忠实模型，因为这些小鼠也无法在体细胞中对DUX4进行表观遗传抑制，导致散发性肌核中存在DUX4蛋白。.

SMCHD1 编码一种保存完好的蛋白质，但其功能在很大程度上还不清楚。对小鼠的研究表明，Smchd1 在 DNA 甲基化的建立和/或维持、X 染色体失活以及几个印记基因和群集基因的调控中发挥作用。我们的研究小组正在与 Marnie Blewitt 博士（沃尔特-伊莱扎-霍尔医学研究所）进行合作。

她参与了N-乙基-N-亚硝基脲（ENU）诱变筛选，以确定表观遗传重编程的修饰因子。除了众所周知的Smchd1功能缺失突变体Smchd1MommeD1之外，她还发现了一种错义Smchd1变体，我们现在称之为Smchd1Fresia变体，它可能是一种超形态变体。这是一个令人兴奋的发现，因为它表明可能存在天然的SMCHD1变体，可以保护肌肉不表达DUX4。.

在这个项目中，我将检验这样一个假设：特定的SMCHD1变体要么会增加SMCHD1的活性，要么会导致SMCHD1的表达增加，从而对D4Z4重复阵列的染色质结构和DUX4的表达产生影响。在具体目标1中，我将利用我们的转基因D4Z4- 2.5小鼠，确定Smchd1Fresia变体对体内D4Z4重复阵列染色质和表达水平的功能影响。在具体目标2中，我将确定Smchd1Fresia变体和5个SMCHD1变体在肌肉细胞培养中可能作为高形态等位基因的影响。在具体目标 3 中，我将在我们广泛且特征明显的生物库中寻找新的潜在 SMCHD1 高形态变异体。.

面岬肱肌营养不良症（FSHD）是一种人类特异性显性遗传病，由染色体 4q35 上的 D4Z4 重复序列收缩和表观遗传环境放任引起。这些遗传和表观遗传环境导致患者肌肉萎缩，肌肉群的穿透率和进展率差异很大。FSHD领域的最新研究进展表明，每个D4Z4重复序列都包含一个名为DUX4的基因，只有收缩阵列中最远的重复序列能够产生可翻译的致病转录本，即DUX4-fl。最近，彼得-琼斯（Peter Jones）博士成功地培育出了第一批可繁殖的诱导型 DUX4-fl 转基因小鼠，称为 FLExDux4+/-; ACTA-MCM+/-。目前，我们和其他实验室正在利用这种小鼠模型研究可能对 FSHD 患者有效的新型药物。在迪恩-伯金博士的实验室里，我们曾进行过一次大规模的药物筛选，以确定 ITGA7（编码 alpha7 lntegrin 的基因）的小分子增强剂。在其他肌肉萎缩症小鼠模型中研究这些 “命中 ”化合物时，我们观察到，一种精选药物在预期增加 alpha7 lntegrin 的同时，还大大提高了肌肉再生能力。这种再生是在端粒长度没有缩短的情况下发生的。我们继续对 FLExDux4+/-; ACTA-MCM+/- 小鼠模型进行了初步处理，虽然我们发现 DUX4-fl 靶基因的表达或活性没有下降，但我们确实发现体内外肌肉力量的产生有了很大的提高。我们假设，Stryka-001 对经他莫昔芬处理的 FLExDux4+/-:ACTA-MCM+/- FSHD-like 小鼠模型的治疗将改善 DUX4-fl 诱导的肌肉损伤后的肌肉再生和恢复。如果成功，这项技术将对 FSHD 患者的治疗产生直接影响，并将与其他即将推出的针对 DUX4-fl 的治疗干预措施相结合，发挥巨大作用。.

面囊肱肌营养不良症（FSHD）是最常见的神经肌肉疾病之一。由于对其分子发病机制了解不全面，目前尚无治疗方法。该病是由于编码骨骼肌中通常沉默的转录激活因子的双同源染色体 4（DUX4）基因异常表达所致。在 FSHD 中，异位 DUX4 表达会激活促凋亡转录程序，导致肌肉细胞丢失和变性。虽然阻断 DUX4 诱导的毒性是一种可行的治疗方案，但人们对 DUX4 引发细胞死亡的机制知之甚少，而且目前还不知道 DUX4 活性的调节因子。因此，在考虑未来的药物设计时，确定能够阻止 DUX4 激活毒性的因素至关重要。.

我们发现了一种能够阻断 DUX4 活性的新型分子。.

我们计划解决以下问题：

1. DUX4 与抑制剂相互作用的分子决定因素是什么？
2. 抑制剂能否用于治疗目的？

我们的项目将使人们更好地了解 DUX4 的作用机制，以及如何阻断其毒性活动以治疗前列腺增生症。.

面岬肱肌营养不良症（FSHD）是一种常见的肌肉萎缩性疾病，由位于 4q35 的第 4 号染色体副染色体上的 D4Z4 巨卫星重复序列的遗传和表观遗传异常共同引起。最常见的 FSHD1 与 D4Z4 阵列从未受损伤个体的 11-100 个重复序列收缩到不足 10 个重复序列有关。在另外 5% 的病例（FSHD2）中，D4Z4 区域没有收缩。这两种形式都与该区域的表观遗传学变化有关，如 DNA 低甲基化和异染色质组蛋白标记的缺失，从而使该区域易于转录。如果在提供 polyA 信号的允许 4qA 等位基因上存在这种低甲基化的 D4Z4 阵列，就会从末端 D4Z4 重复序列中产生一个稳定的转录本，用于转录名为 DUX4 的转录因子。.

当 DUX4 在骨骼肌中异位表达时，会破坏肌肉细胞的转录网络并产生细胞毒性作用。然而，FSHD病理的分子驱动因素仍然鲜为人知。受伤后，健康肌肉会与免疫系统合作，启动复杂的修复程序，其中包括激活肌肉祖细胞（卫星细胞），这些细胞会增殖和分化以修复损伤。前列腺增生症患者的这些过程受到错误调控，导致炎症反应异常、修复无效和肌纤维萎缩。了解FSHD肌肉无法有效激活肌肉修复程序的原因，对于开发新型治疗策略非常重要。.

在 FSH Society Shack Family and Friends 研究基金 FSHS-82013-06 的部分资助下，我们最近完成了一项广泛的 RNA-seq 转录组学分析（Banerji C.R.S、Panamarova M.、Hebaishi H.、White R.B.、Relaix F.、Severini S. 和 Zammit P.S. (2017)。PAX7靶基因在FSHD骨骼肌中受到全局性抑制。Nature Communications 8: 2152 (10.1038/s41467-017-01200-4)。多变量回归分析显示，在所分析的每个数据集中，有 180 个基因与 FSHD 密切相关。对这 180 个基因进行的基因组富集分析表明，在所有 FSHD 细胞系中，对巨噬细胞协调肌肉修复起核心作用的转录因子的靶基因都受到了显著抑制。然而，这种转录因子的抑制对 FSHD 肌肉修复的影响目前尚不清楚。.

本研究旨在确定这种转录因子在前列腺增生症中的作用，这有助于增强前列腺增生症患者的肌肉修复，从而改善肌肉萎缩。该项目的总体目标是更好地了解前列腺增生症患者肌肉修复与免疫系统之间的相互作用。.

为了推进前列腺增生症临床试验的准备工作，需要确定疾病活动和进展的生物标志物，以帮助评估治疗缓慢进展疾病的疗效。对于这种疾病，选择性和针对性的方法是可取的，而且需要将分子研究结果与疾病活动和进展的其他指标相关联，以减少结果的变异性。我们开发了一种独创的方法，将肌肉成像、微透析和蛋白质组分析相结合，以识别和追踪单块肌肉的病理过程。这种方法包括对同一前列腺肥大症患者和对照组中具有不同磁共振成像特征（即正常肌肉与显示早期受累迹象的肌肉）的肌肉间质进行蛋白质组分析，从而在磁共振成像提供的全面而敏感的评估框架内确定分子结果的背景。已采集样本的初步证据证明了分析的可行性。在发现阶段之后，我们还计划开发一种灵敏、稳健的蛋白质组工作流程，以验证并提高蛋白质/肽的检测和定量灵敏度。我们将采用高分辨率液相色谱-平行反应监测（LC-PRM）-质谱（MS）分析模式，分析微透析液中差异表达的蛋白质的目标肽的精确质量。还将在接受微透析的 FSHD 患者血清中开发和测试蛋白质组方案，以发现生物标记物。.

我们的研究结果可以为采用综合方法发现和描述新型组织和循环生物标记物提供有价值的信息，并为将创新技术应用于 FSHD 及其他潜在的神经肌肉疾病提供初步证据。通过鉴定FSHD肌肉中失调的生化通路，进一步了解疾病的病理生理学，有助于开发新的靶向疗法。.

面岬-肱肌营养不良症（FSHD）是一种常见而又独特的肌肉营养不良症，需要多种因素为疾病的表现创造 ‘允许 ’状态。近年来，一些遗传（DUX4）和表观遗传（低甲基化）因素与前腓骨肌营养不良症的发病机制有关；然而，该领域显然还没有阐明疾病表现所需的所有因素。越来越多的临床证据表明，存在能够调节 DUX4 转录本和/或蛋白质功能的修饰基因。本项目拟采用的基因组编辑技术的最新进展应能使我们发现这些剩余的缺失环节。通过在基因组 DNA 中系统地引入功能缺失突变，我们可以在基因组中寻找答案，从而解释患者之间的表型差异，以及 DUX4 在某些个体中的非穿透性效应。在本项目中，我们提出了一种有针对性的基因组规模基因敲除筛选方法，以确定在DUX4表达失活时能减少其表型影响的基因。我们假设，DUX4 的基因靶点存在，失去这些靶点将使 DUX4 无法触发基因表达失调级联，从而减弱其毒性。这些候选基因很可能是前列腺增生症的遗传修饰因子，通过下游测序和计算分析，很容易确定这些DUX4 ‘抗性 ’细胞群中富集的CRISPR靶基因。这样就可以生成一份完整的候选基因列表，这些基因可能会影响与 DUX4 表达不当相关的致病结果。确定的基因将与我们的非显性携带者全基因组测序数据进行交叉比对，以寻找序列变异，从而缩小有希望进行功能性后续研究的候选基因范围。我们将在已建立的FSHD斑马鱼模型中对候选修饰基因进行验证，以挽救表型，确认其功能意义。此外，我们还将恢复 FSHD 患者细胞库，在这些允许等位基因条件下对候选基因进行基因组编辑，随后测量已知 FSHD 生物标志物的表达变化。前列腺增生症是一种极具挑战性的疾病，仅凭我们的力量无法解决尚存的未解之谜。因此，我们的建议涉及多机构合作，将丰富的患者资源（韦尔斯通中心）、最新的基因组学技术（布罗德研究所）和完善的FSHD动物模型（波士顿儿童医院）结合在一起。鉴定这些DUX4抗性的修饰基因不仅能为了解FSHD的发病机制提供宝贵的信息，还能为FSHD患者的治疗干预提供直接靶向的可靠线索。.

面岬肱肌营养不良症（FSHD）有两种类型，即 FSHD1 和 FSHD2。FSHD1 和 FSHD2 的致病基因是 DUX4。DUX4在FSHD1和FSHD2中表达的原因分别是D4Z4大卫星重复单元的收缩和SMCHD1的突变，以及携带DUX4多聚腺苷酸化位点的4qA等位基因。此外，SMCHD1 还可改变受 FSHD1 影响的家族的疾病严重程度。在此，为了了解表达 DUX4 的分子机制，我试图确定 SMCHD1 如何参与 DUX4 的调控（目标 1 和目标 2）。此外，我还试图阐明 Smchd1 在 FSHD1 模型小鼠中的作用（目标 3）。目标 1.确定微型 SMCHD1 用于抑制 DUX4 表达的分子机制。迷你SMCHD1（外显子1-9.41-48）抑制DUX4的表达。为了明确迷你SMCHD1在FSHD1肌母细胞中增加DUX4表达的机制，我测试了迷你SMCHD1是否减少了内源性SMCHD1蛋白的数量，以及/或者迷你SMCHD1是否与D4Z4区域结合并取代了内源性SMCHD1。目标2.鉴定 SMCHD1 的裂解分子机制。在对照组和 FSHD1 肌肉细胞中，内源性 SMCHD1 上可能存在全长和裂解片段条带。我的假设是，缺乏假定裂解位点的 SMCHD1 可能比内源性 SMCHD1 更稳定，而且它抑制 DUX4 表达的能力更强。为了验证这一点，我将首先利用生物信息学和分子生物学工具确定哪种序列能被哪种蛋白酶识别。接下来，我将研究参与裂解 SMCHD1 的蛋白酶及其识别位点是否可能成为治疗干预的新靶点。目标3.确定Smchd1在FSHD1模型小鼠中的作用。SMCHD1水平降低会抑制FSHD1肌母细胞中DUX4的表达。为了研究Smchd1是否会影响FSHD1模型小鼠中DUX4的表达，我将比较Smchd1条件性基因敲除小鼠（D4Z4-2.5；Myf5Cre/+；Smchd1flox/flox）和对照小鼠（D4Z4-2.5；Myf5+/+；Smchd1flox/flox）在损伤条件下和正常成熟肌肉中DUX4的表达。.

就 FSHD 而言，目前的模型表明，D4Z4 的缩短、随后 DNA 在允许的 4qA 等位基因上的低甲基化会诱导 DUX4 转录物的表达，进而激活其他基因，导致肌肉特异性表型。一小部分患者（约 5%，FSHD2）的临床表型相同，但没有 D4Z4 阵列收缩。然而，这些患者中的大多数都表现出严重的 D4Z4 低甲基化，其中一些与 SMCHD1（含染色体铰链域的结构维护）基因突变有关。因此，表观遗传学改变与前列腺增生症密切相关，但其潜在机制仍不清楚，SMCHD1蛋白在D4Z4调控中的功能也不明确。SMCHD1 是染色体蛋白 SMC 家族中一个 230 kDa 的大型非典型成员。其主要保守结构域是羧基末端的 SMC 铰链结构域，两侧是短线圈盘绕区域、氨基末端的 GHKL ATPase 结构域以及 ATPase 结构域附近与溴邻近同源（BAH）结构域同源性较弱的区域。SMCHD1 能够通过 SMC 铰链结构域进行同源二聚化，并优先加载到富含 H3K9m3 的染色质上。在小鼠中，Smchd1 的主要特征是参与 X 染色体的失活。Smchd1 还参与了重复 DNA 序列的沉默、成群印迹基因的调控以及单平行表达的原粘连蛋白基因簇的调控。在端粒中也发现了 SMCHD1，端粒长度与 SMCHD1 的富集直接相关。然而，它在端粒中的确切作用尚不清楚。本项目旨在了解SMCHD1在肌肉分化过程中染色质调控和DNA甲基化中的作用，从而揭示该蛋白如何促进FSHD疾病的生理病理机制。为此，我们将使用携带不同 SMCHD1 突变的 FSHD1 和 FSHD2 患者的诱导多能干细胞。我们的团队已经开发出一种利用 hiPSCs（肌母细胞和肌管）生产骨骼肌细胞的策略，该策略将用于监测分化过程中表达失调的基因，并确定 SMCHD1 与染色质结合的概况。该项目的目标是确定疾病中失调的通路，以便进一步了解疾病的病理机制。.

面岬肱肌营养不良症（FSHD）是一种与 DUX4 基因抑制相关的遗传显性进行性肌肉营养不良症。目前，FSHD 基础研究和治疗测试的主要障碍之一是缺乏合适的动物模型，现有的尝试要么过于严重，要么完全没有肌肉疾病。我们已经开发出一种新的转基因小鼠，这种小鼠具有组织特异性和可滴定的 DUX4 表达，能显示骨骼肌疾病，本申请旨在将其开发成一种动物模型，适合研究 DUX4 蛋白在骨骼肌纤维和骨骼肌干细胞中的作用。这项工作有助于研究体内 DUX4 基因导致的骨骼肌病理学，并有可能测试基于抑制 DUX4 蛋白或 RNA 的 FSHD 治疗方法。.

面岬肱肌营养不良症（FSHD）是一种发育障碍性疾病，在这种疾病中，DUX4的表达在早期肌生成过程中并没有被抑制。建立人类早期肌生成的适当模型可以阐明 FSHD 的新致病机制。在FSH协会最近两次（2012年和2014年）的慷慨资助下，我们建立了多个FSHD和健康对照人类诱导多能干细胞系（hiPSCs）。此外，Lee实验室还开发了一种新颖的 ‘基于化合物 ’的骨骼肌分化方法，无需过度表达致肌转录因子、动物产品甚至重组蛋白（发表于2016年，Choi等人，《细胞报告》）。这一新方案相对较快（约 30 天），并忠实地遵循了体内肌生成。例如，我们的基因报告系统（MESOGENIN1::eGFP，作为体节前期的标记）显示，超过80%的分化细胞正在经历体节阶段，这表明我们的方案确实在模拟发育期的肌生成。我们之前获得的资助（2014年由FSH协会资助）结果表明，SSEA3+未分化iPSCs、MESOGENIN1::GFP+体节细胞，甚至NCAM+/HNK1-肌母细胞都可能不是鉴别DUX4和/或FSHD相关转录差异影响的最佳细胞类型（请参阅附件四中的研究进展报告）。在 FSHD 患者中，尚不清楚哪些细胞类型会表达 DUX4，而且在人类原代肌母细胞培养物中也很难找到任何具有 DUX4 免疫反应的细胞。扎米特小组最近的一项研究表明，Dux4在骨骼肌再生过程中短暂表达，Dux4通过靶基因的转录激活维持Pax7的表达，Dux4诱导干细胞样和低分化状态的特征。这些数据让我们推测，DUX4可以在FSHD iPSCs的PAX7表达细胞中表达，或者至少PAX7表达细胞应该是研究FSHD分子发病机制的正确细胞类型。我的研究小组已经开发出一种产生 ‘基因敲入 ’PAX7::GFP报告基因系的策略，我们已经建立了多个PAX7::GFP报告基因人类iPSCs。我们将继续努力生成 PAX7::GFP FSHD-hiPSC 和对照-hiPSC 株系（每种株系有三种基因型），以分离出推定的骨骼肌干细胞/祖细胞，然后进行详细的细胞和分子分析。这些方法可为FSHD疾病机制提供新的见解，新开发的细胞系可与其他研究小组共享，用于未来的体外和体内研究。.

前列腺肥大症是最常见的肌肉萎缩症之一，迄今尚无治疗或预防方法。其特征是 D4Z4 阵列中抑制性表观遗传标记的缺失，导致染色质松弛，当与允许的 4 号染色体相关联时，正常情况下沉默的 DUX4 蛋白表达，其 ORF 存在于每个 D4Z4 重复序列中。DUX4 是一种转录因子，通过诱导下游基因产生毒蛋白，这可能在前列腺增生症的发病/发展过程中发挥重要作用。.

DUX4通常被描述为对前列腺肥大症患者的肌肉细胞具有毒性，但DUX4表达驱动的细胞丢失机制在很大程度上仍然未知。已有多篇文献对体外和体内 DUX4 依赖性细胞死亡机制进行了研究，但主要集中在细胞凋亡途径上。然而，在FSHD患者的活检组织中，细胞主要以坏死形态死亡，而坏死途径却从未被研究过。我们的目标是研究这种病理学中的坏死机制。.

这项工作将有助于更好地了解前列腺增生症的病理生理学，解释 DUX4 表达与前列腺增生症病理生理学之间的联系，并有助于确定新的治疗靶点。.

面岬肱肌营养不良症（FSHD）是一种目前无法治疗的遗传病，患者会出现进行性肌无力。导致 FSHD 的基因改变被定位在染色体 4q35.2 上的 D4Z4 大卫星重复序列上。在健康人体内，该区域有11-100个D4Z4拷贝，并保持内在沉默。然而，在前列腺增生症患者中，D4Z4重复序列被收缩为少于11个拷贝，导致D4Z4的表观遗传去抑制和双同源染色体4（DUX4）的转录激活，DUX4是D4Z4中的一个转录因子。尽管这些现象已被详细记录，但导致 DUX4/D4Z4 失调的因素和机制在很大程度上仍然未知。最近的研究表明，Dux4具有转录反式活性，对生殖系发育和免疫反应基因有正向调节作用，而这些基因可能会导致FSHD的发病。然而，当Dux4在成肌细胞中过度表达时，发现一部分Dux4的直接靶基因被下调，这突显了Dux4可能参与了功能不同的复合物来调控基因表达。为了探究DUX4/D4Z4的调控因子并剖析Dux4的功能，我们建议重建D4Z4位点的表观遗传景观，筛选激活DUX4表达的转录因子，并绘制Dux4的相互作用组图，以分别揭示D4Z4抑制、DUX4表达和Dux4在染色质上功能的潜在调控因子。具体来说，将利用分离的染色质片段蛋白质组学（PICh）纯化和鉴定与D4Z4基因座结合的蛋白质。将使用聚焦 shRNA 文库筛选可能调控 DUX4 表达的候选转录因子。将通过染色质免疫沉淀或 DUX4 蛋白的层析分离，然后进行质谱分析，鉴定 Dux4 的相互作用者。采用这些发现靶点的方法后，将在正常和前列腺肥大症骨骼肌管以及患者活检组织中进行功能验证。总之，这些尝试将阐明FSHD发病的分子机制，并揭示治疗FSHD的潜在靶点。.

肌肉萎缩是神经肌肉疾病面临的最大挑战之一。肌节蛋白是肌肉质量的负调控因子，下调肌节蛋白被认为是一种很有前景的平衡肌肉萎缩的工具，制药公司已经开发出至少 6 种抗肌节蛋白分子。然而，迄今为止，临床试验的结果令人失望，几乎没有达到临床终点。这些结果令人惊讶，因为在对健康志愿者进行的第一阶段试验中，观察到肌肉质量有所改善。.

人们提出了几种假设，其中包括抗肌节蛋白分子疗效不佳或药物本身的特异性。在我们的研究中，我们根据肌节蛋白通路中几种效应物的表达水平研究了另一种可能性。我们的实验表明，对患者进行分层（基于这些效应物的表达）可能有助于确定患者的治疗资格。.

前列腺增生症协会提供的资金将帮助我们完成这些实验，这些实验对神经肌肉患者，尤其是前列腺增生症患者可能具有重要意义，并可能对未来和当前使用肌生成抑制剂的临床试验产生深远影响。.

前列腺增生症的发病与患者骨骼肌中DUX4基因的抑制有关。然而，在肌肉活检中也发现了表达 DUX4 的个体，但他们并没有表现出任何临床症状。因此，虽然DUX4的抑制可能是FSHD表型的必要条件，但这还不够。这表明可能还有其他因素改变了FSHD的疾病表型。我们利用蛋白质组学方法筛选了可能作为疾病调节因子的与 DUX4 相互作用的蛋白质，并确定多功能 C1QBP 为候选蛋白之一。众所周知，C1QBP 可调节受 DUX4 表达影响的几种分子通路，包括基因表达、氧化应激和细胞凋亡。在我们的初步研究结果中，我们发现 C1QBP 在成肌细胞中受到动态调控。在成肌细胞中，它主要定位于核外的带状结构，但当成肌细胞融合成肌管时，它似乎会迁移到核外围。DUX4 的表达导致细胞核中 C1QBP 浓度增加，支持了 DUX4 和 C1QBP 形成功能性相互作用的假设。重要的是，已知 C1QBP 可与细胞内外的信号分子透明质酸（HA）结合，从而调节其磷酸化状态。我们发现，用抑制 HA 合成的 4- 甲基伞形酮（4MU）处理细胞，减少细胞内的 HA，会导致 DUX4 靶基因表达的急剧下降。这使它有可能成为前列腺增生症的治疗药物。4MU是一种特别值得开发的药物，因为它在欧洲已被用于治疗胆汁运动障碍，并且在多项研究中证实了其短期安全性。此外，人们还在细胞培养和动物模型中研究 4MU 治疗特定癌症的效果。.

在本项目中，我们将评估 4MU 作为 FSHD 治疗药物的能力，并研究其作用机制。我们观察到，无论是在肌管中还是在肌母细胞中过表达 DUX4 时，4MU 都能抑制 DUX4 靶基因的表达。我们推测，这是由于 HA 的缺失改变了 C1QBP 的翻译后修饰，从而干扰了其与 DUX4 相互作用并充当转录辅助因子的能力。这可能表现为阻止 C1QBP 直接与 DUX4 结合、改变 C1QBP 的亚细胞定位或导致 C1QBP 的稳定性发生变化。我们将对这些可能性逐一进行研究评估。最后，我们将利用本实验室建立的 FSHD 小鼠异种移植模型进行剂量递增研究，以确定 4MU 治疗是否能抑制 DUX4 靶基因在体内的表达。这将更好地评估 4MU 作为 FSHD 治疗药物的潜力。.

反义寡核苷酸（AOs）是经过化学修饰的单链 DNA、RNA 或化学类似物分子，能够调节特定靶基因的表达。随着反义化学物质，特别是磷酰二氨吗啉寡聚体（PMOs）的发展，许多研究都在探索反义技术的治疗潜力。AO 介导的外显子跳越是目前治疗杜氏肌营养不良症（DMD）最有前景的治疗方案之一。重要的是，BioMarin 和 Sarepta 已宣布美国食品药品管理局 (FDA) 已接受对 drisapersen（2’OMePS PRO051）和 eteplirsen（PMO AVI-4658）治疗 DMD 的新药申请 (NDA) 的审查。.

我们项目的总体目标是抑制DUX4的表达，并开发一种基于AOs的FSHD治疗方法。我们选择靶向DUX4 mRNA的3’关键元素，并已经取得了有力的成果，证明了这种方法的可行性。我们首次在体外证明，靶向功能性 PAS 可以成为一种有效的遗传病治疗策略。我们观察到，靶向 DUX4 3’key 元素会导致 DUX4 的有效消亡，不会重定向多聚腺苷酸化，并能防止 DUX4 下游基因的异常表达。.

我们现在的目标是：(i) 通过开发序列优化的 AON 来改善 DUX4 mRNA 的灭绝；(ii) 在体内验证这些 AO。在第一个目标中，我们将优化针对 DUX4 mRNA 3’ 关键元素的 AO 药物的序列和化学成分。在第二个目标中，我们将在建立一个携带有 DUX4 mRNA 3’UTR 报告基因（LacZ）的新小鼠模型后，测试在动物模型中全身给药最有效的抗 FSHD AO 药物的递送和有效性。将开发两种策略：直接注射活体PMO和将PMO载入AAV载体。在第一种情况下，小鼠将接受治疗方案，即以裸体形式或与细胞穿透分子（如辛卡胍或CPPs）共轭的形式静脉注射全身给药治疗优化的AOs。在第二种情况下，AOs 将在 U7 启动子的控制下进行载体化，例如用于 DMD 的外显子跳过。众所周知，AAV 可靶向全身肌肉而无毒副作用。.

常染色体显性面肩胛肱肌营养不良症（FSHD）是发病率第三高的肌肉营养不良症，每两万人中就有一人患病。1954年，FSHD被正式归类为一种主要的肌肉营养不良症，但导致该病的致病因素直到最近才开始受到关注。目前有多项研究支持一种 FSHD 发病模型，该模型涉及灵长类特异性 DUX4 基因的异常表达，该基因编码一种肌毒性转录因子。DUX4 基因的出现代表了 FSHD 领域的势头转变，因为它为治疗设计提供了一个重要靶点。事实上，由于前列腺肥大症目前无法治疗，开发有效的疗法是该领域的关键需求。FSHD的治疗应以抑制DUX4为中心，可以通过沉默基因或转录本或消除DUX4蛋白的毒性作用来实现。本研究的总体目标是鉴定、描述并最终抑制可能导致 DUX4 蛋白在 FSHD 肌肉中毒性作用的 DUX4 蛋白修饰。阐明DUX4蛋白的功能是如何调节的是该领域尚未满足的一个重要需求。.

DUX4 基因编码一种转录因子，可激活下游毒性通路，包括细胞凋亡级联。我推测，翻译后修饰（PTM）可能是影响 DUX4 蛋白功能的一个重要机制。PTM 在配体结合亲和力、亚细胞定位和蛋白质稳定性方面起着关键作用。我的主要目标是首先确定 DUX4 是否会被翻译后修饰，然后绘制 DUX4 PTMs 图，并确定它们对 DUX4 诱导毒性的贡献。我的目标是确定 DUX4 PTMs 的作用，这将使我们有可能了解其蛋白质功能和调控。通过实现这一目标，我们希望建立一个治疗干预框架，旨在破坏 DUX4 的修饰并防止肌毒性。.

目标1：确定DUX4的翻译后修饰 DUX4转录因子与前列腺肥大症的肌肉病变有关，并对许多其他非肌肉细胞类型具有毒性。然而，一些细胞和组织似乎能抵御与DUX4相关的损伤，包括DUX4天然高水平表达的睾丸以及未表现出FSHD的携带者的肌肉。一些细胞抵抗DUX4相关损伤的机制尚不清楚，但DUX4修饰基因可能会影响疾病的渗透性。由于PTM能深刻影响转录因子的活性，我推测DUX4蛋白也可能受到PTM的调控，因此介导这些PTM的酶可能会影响DUX4的毒性。在初步研究中，我利用 DUX4 的质谱分析发现 DUX4 蛋白被甲基化和磷酸化修饰。为此，我将在多种细胞类型（包括内源表达 DUX4 的人类肌母细胞和灵长类动物睾丸）中确定 DUX4 的 PTM 特征。从这些细胞类型中分离出的 DUX4 的修饰特征差异将有助于深入了解 DUX4 蛋白的组织特异性调控，并可能提供有关 DUX4 在组织或细胞中的不同毒性的信息。.

目标 2：研究磷酸化对 DUX4 功能的作用 我的初步研究结果显示，DUX4 的 N 端和 C 端结构域中存在大量磷酸化残基。为此，我提议利用诱变不可逆地模拟或消减 DUX4 磷酸化残基来研究每个磷酸化事件的影响。然后，我将利用之前在初步研究中确定的几种结果测量方法来确定这些 DUX4 突变体在体外的影响。其中包括 DUX4 DNA 结合亲和力、对关键配体相互作用影响的评估、DUX4 二聚化、细胞毒性和基因靶点激活。这项工作将有助于迈出重要的第一步，通过不同程度地影响 DUX4 的磷酸化状态，开发出可以预防 DUX4 介导的毒性的疗法。.

我们将向包括 MDA 和 FSH 协会在内的基金会提交正式拨款申请，并考虑寻求一些行业资助。但是，这需要时间（几个月），而且我们不再有可支配资金来支持小鼠群落。我们希望尽快扩展、描述和发表这一模型，并为此寻求过渡资金。我们的目标和首要任务是在可行的情况下，尽快将该模型提供给该领域任何需要的人。.

我们实验室与A. Belayew实验室最初提出，DUX4的异常表达对细胞有害，是FSHD的发病机制之一。我们证实，DUX4是一种核蛋白，在培养的FSHD肌母细胞中内源性表达，在转染细胞中表达时具有促凋亡和细胞毒性作用。我们最近分析了导致其毒性、亚细胞转运和核定位的 DUX4 分子结构域。在这些研究中，我们发现 DUX4 的 C 端区域有一个 LLXXL 矩阵，它存在于核激素受体（NRs）的共调控因子中。我们实验室的初步研究表明，DUX4 是黄体酮 NR 的共调控因子。我们还发现，黄体酮能保护培养细胞免受 DUX4 的毒性作用。在本项目中，我们将研究 DUX4 作为性激素 NR 的共调控因子的作用，以及性激素对 DUX4 毒性的保护作用。这些研究有助于了解 DUX4 的正常功能及其在前列腺增生症中的致病作用，以及未来治疗前列腺增生症患者的合理方法。.

面岬-肱肌营养不良症（FSHD）是一种常见而又独特的肌肉营养不良症，需要多种因素为疾病的表现创造 ‘允许 ’状态。近年来，一些遗传（DUX4）和表观遗传（低甲基化）因素与前腓骨肌营养不良症的发病机制有关；然而，该领域显然还没有阐明疾病表现所需的所有因素。越来越多的临床证据表明，存在能够调节 DUX4 转录本和/或蛋白质功能的修饰基因。本项目拟采用的基因组编辑技术的最新进展应能使我们发现这些剩余的缺失环节。通过在基因组 DNA 中系统地引入功能缺失突变，我们可以在基因组中寻找答案，从而解释患者之间的表型差异，以及 DUX4 在某些个体中的非穿透性效应。在本项目中，我们提出了一种有针对性的基因组规模基因敲除筛选方法，以确定在DUX4表达失活时能减少其表型影响的基因。我们假设，DUX4 的基因靶点存在，失去这些靶点将使 DUX4 无法触发基因表达失调级联，从而减弱其毒性。这些候选基因很可能是前列腺增生症的遗传修饰因子，通过下游测序和计算分析，很容易确定这些DUX4 ‘抗性 ’细胞群中富集的CRISPR靶基因。这样就可以生成一份完整的候选基因列表，这些基因可能会影响与 DUX4 表达不当相关的致病结果。确定的基因将与我们的非显性携带者全基因组测序数据进行交叉比对，以寻找序列变异，从而缩小有希望进行功能性后续研究的候选基因范围。我们将在已建立的FSHD斑马鱼模型中对候选修饰基因进行验证，以挽救表型，确认其功能意义。此外，我们还将恢复 FSHD 患者细胞库，在这些允许等位基因条件下对候选基因进行基因组编辑，随后测量已知 FSHD 生物标志物的表达变化。前列腺增生症是一种极具挑战性的疾病，仅凭我们的力量无法解决尚存的未解之谜。因此，我们的建议涉及多机构合作，将丰富的患者资源（韦尔斯通中心）、最新的基因组学技术（布罗德研究所）和完善的FSHD动物模型（波士顿儿童医院）结合在一起。鉴定这些DUX4抗性的修饰基因不仅能为了解FSHD的发病机制提供宝贵的信息，还能为FSHD患者的治疗干预提供直接靶向的可靠线索。.

面肩胛肱肌营养不良症（FSHD）是最常见的肌肉营养不良症之一，通常在发病早期影响面部、肩部和手臂的肌肉，但随着时间的推移，也可能影响任何骨骼肌。50岁以上的FSHD患者中有20%需要使用轮椅。由于分子技术的进步已经为未来的FSHD临床试验确定了潜在的治疗目标，因此迫切需要为FSHD的治疗制定可靠、灵敏的疗效指标。用于评估力量随时间变化的现有FSHD结果测量方法--手动肌肉测试（MMT）和定量肌力测定（QMT）--已在一项大型自然史研究中得到验证，但无法证明一年以内的疾病进展情况。目前还不清楚综合力量评分的微小变化对患者意味着什么。功能性任务似乎对患者更有意义，因为它们可以测量日常任务中的运动表现，但对FSHD在不到3年内的变化并不敏感。在 FSHD 早期治疗试验中，使用这种力量或功能结果测量来显示疾病进展的减缓，需要大量受试者和较长的治疗间隔，这将大大阻碍药物开发进程。对于这种罕见疾病，尤其是在考虑多种治疗方法的情况下，患者的就诊机会有限，这就很成问题。对力量和整体残疾状况进行更灵敏的替代结果测量，可以大大缩短早期临床试验的时间，加快治疗发现过程。对于肌肉功能的早期变化，执行功能性运动任务时的动态运动测量可能比等长力量测量更敏感。之前的一项研究利用基于实验室的运动分析确定了一部分 FSHD 患者，尽管他们的手动肌肉测试正常，但运动参数却异常。以前进行此类测量需要专门的运动实验室，而便携式无线运动传感器的同步网络使复杂的功能性运动分析在临床试验环境中更加方便实用。.

本研究项目的长期目标是建立一种定量评估工具，用于评估前列腺肥大症患者活动能力的变化。我们将使用便携式无线运动分析系统对定时起立、安静站立时的姿势摇摆和手臂运动范围进行检测。我们计划在现有的堪萨斯大学医学中心前沿试点资助项目的基础上，确定通过便携式无线运动传感器获得的、对检查前列腺增生症患者非常重要的具体结果指标，并确定这些指标的可靠性和横断面有效性。在目前的前列腺肥大症协会研究中，我们建议扩大目前的试点研究，增加 6 个月和 12 个月的随访。我们将对 20 名经基因确诊并受临床影响的 FSHD 患者（10 名轻度至中度患者和 10 名中度至重度患者）进行为期 12 个月的纵向研究，以确定无线运动分析对 FSHD 疾病进展的反应能力，确定这些指标的最小可检测变化和最小临床重要性变化，并使用因子分析创建汇总评分（如上肢、下肢），供未来临床试验使用。.

现向前列腺增生症协会申请资金，用于支付研究生张远帆（Yuanfan “Tracy” Zhang）在瓦格纳实验室剩余几个月的费用。Tracy 是细胞与分子医学专业的五年级研究生，专门研究前列腺增生症。她的毕业论文工作是建立、验证和使用 FSHD 的新型模型。她以第一作者身份在《人类分子遗传学》上发表了论文（Zhang et al.）她目前正在利用该模型展示反义寡核苷酸敲除DUX4-fl治疗前列腺增生症的概念验证。虽然这项工作总体上得到了密西西比大学FSHD Wellstone的支持，但Tracy已不再得到Wellstone的支持，因此需要资金来支付她的工资和福利，以完成这个项目。.

我们的研究目标是确定面肱骨肌营养不良症（FSHD）的致病机制并开发新的治疗策略。我们发现，双同源异构体蛋白DUX4的全长异构体（DUX4-FL）而非DUX4-S（DUX4的短异构体）会抑制蛋白质的周转，并导致泛素表达异常和TDP-43的核聚集，TDP-43是容易聚集的RNA/DNA结合蛋白之一，曾与肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）和包涵体肌炎（IBM）有关（Homma等人，2015）。这些表型并非DUX4-FL诱导细胞死亡的副作用，当细胞死亡被caspase抑制剂阻断时，这些表型会增强。这些数据表明，DUX4-FL 会诱导蛋白质异常降解，进而导致细胞毒性。重要的是，在 DUX4-FL 的内源启动子和外源表达细胞中，均观察到泛素化蛋白的异常沉积和 TDP-43 的核聚集。因此，从内源启动子产生的DUX4-FL足以促进发病，我们的研究结果确定了抑制蛋白质周转和受损的蛋白稳态是FSHD的潜在病理机制。我们现在提议找出DUX4-FL抑制蛋白质周转和促进蛋白质异常聚集的机制。在具体目标 1 中，我们将确定 DUX4-FL 表达抑制蛋白酶体功能的机制。我们将从 DUX4 阳性和阴性肌管中分离蛋白酶体，并检测蛋白酶体的数量和活性。如果蛋白酶体的内在活性和/或数量因 DUX4-FL 表达而不变，那么我们将研究泛素化蛋白质在 DUX4-FL 阳性肌管中异常积累的间接机制。在具体目标 2 中，我们将检查 FSHD 肌肉活检组织，以确定是否存在蛋白质降解系统功能障碍的迹象。我们将用泛素、TDP-43和其他与肌病和蛋白质聚集疾病相关的蛋白质抗体对FSHD和对照组织进行免疫染色。这项研究的结果可作为 FSHD 的临床标记物。因此，我们建议的研究将为了解DUX4-FL诱导FSHD病理变化的机制提供有价值的见解，这些病理变化可能与其他一些肌病和/或蛋白聚集性疾病有相同之处。这些新知识可以开发基于调节蛋白酶体活性的潜在新治疗策略，并确定 FSHD 的新临床生物标志物。.

面部、肩部和上臂肌肉萎缩症（FSHD）是一种肌肉萎缩症，临床特征是面部、肩部和上臂肌肉进行性无力和萎缩。致病基因是 DUX4，位于第 4 号染色体上介于 11 和 100 之间的 D4Z4 巨卫星重复单元。正常情况下，D4Z4 巨卫星阵列是高甲基化的，DUX4 在正常骨骼肌中不表达，但 D4Z4 巨卫星阵列是低甲基化的，DUX4 在 FSHD 骨骼肌中表达。FSHD有两种类型，即FSHD1和FSHD2，两者在表型上没有区别，而诱导骨骼肌中DUX4异常表达的原因却有区别。FSHD1是由D4Z4大卫星重复单元（1-10）收缩引起的，而FSHD2是由SMCHD1突变引起的。FSHD1 和 FSHD2 又各分为两类。FSHD1的D4Z4大卫星重复大小（1-6个单位和7-10个单位）与疾病严重程度有关。SMCHD1的突变分为单倍性突变和显性阴性突变。此外，在受 FSHD1 影响的家族中，SMCHD1 可改变疾病的严重程度。然而，目前还没有研究检验 SMCHD1 是否有可能有效治疗 FSHD1 和 FSHD2。本提案基于这样一个假设：SMCHD1的过表达会减少FSHD1和FSHD2中DUX4的异常表达。验证这一假设的研究计划大纲如下。.

目的 1.在 FSHD1 和 FSHD2 肌肉细胞中使用强力霉素诱导慢病毒-SMCHD1。我们将使用强力霉素诱导慢病毒-SMCHD1（a 和 b）来确定增加 SMCHD1 的表达对抑制不同突变的 FSHD 中 DUX4 的有效性。SMCHD1由48个外显子组成，具有ATPase和Hinge结构域。我们将使用具有短 SMCHD1 编码序列（c）的强力霉素诱导慢病毒-SMCHD1，确定 SMCHD1 在 FSHD 肌细胞中抑制异常 DUX4 的关键区域。在 FSHD2 中抑制 DUX4 的能力： i) 单倍体不足突变 ii) 显性阴性突变 c. 在 FSHD 肌肉细胞中抑制 DUX4 的能力： i) 全长（1-48 号外显子） ii) 短长（1-10 号、1-20 号、1-30 号、1-40 号外显子）。

目标 2：FSHD 肌肉细胞和 D4Z4-2.5 小鼠中的 rAAV6-SMCHD1。我们将确定重组腺相关病毒 6（rAAV6）-巨细胞病毒（CMV）-SMCHD1 在 FSHD1 和 FSHD2 肌肉细胞和 D4Z4-2.5 小鼠（FSHD1 模型小鼠）中增加 SMCHD1 表达以抑制 DUX4 的效果。此外，为了区分全身和肌肉中的 SMCHD1 对 FSHD 中 DUX4 的抑制作用，我们将选择肌酸激酶和α-肌球蛋白重链（MHCK）基因的 CMV 启动子和增强子/启动子区域，将 rAAV6-CMV-SMCHD1 和 rAAV6-MHCK-SMCHD1 注入 D4Z4-2.5 小鼠。a. 使用 rAAV6-CMV-SMCHD1 抑制 FSHD1 和 FSHD2 肌肉细胞中 DUX4 的能力。.

在本申请中，目标 1 将是进行原理验证实验，证明较高的 SMCHD1 可作为一种有效的潜在疗法；目标 2 将开发一种递送方法，最终可能适合基于 rAAV6 的临床前或临床研究。.

双同源染色体（DUX）基因分布在 3.3 kb 的重复元件中，构成了一个拥有数百个成员的家族，分散在人类基因组中。尽管它们的序列在进化过程中保持不变，证明了它们的功能，但长期以来它们一直被认为是假基因，因此研究很少。然而，有几个 DUX 基因在健康的肌肉细胞中表达。我们的研究小组对导致前列腺增生症的 DUX4 基因和同源的 DUX4c 基因（均位于 4q35）进行了鉴定。这两种编码蛋白都是高度相似的转录因子，只有羧基末端区域不同。这些基因在啮齿动物中没有已知的同源物。不过，小鼠 Duxbl 是与 DUX4 和 DUX4c 相似的旁系亲属，以前曾被证明在肌形成过程中发挥作用。DUX4c 在健康肌肉中表达，在前列腺肥大症和杜氏肌营养不良症（DMD）中被诱导表达。我们之前的数据表明，DUX4c 在正常人的肌肉再生过程中发挥作用，它的激活（如在 FSHD 中）可能会影响多种肌病的肌肉再生。破译尚未研究的人类肌肉蛋白的功能，将增加我们对骨骼肌生理和病理机制的了解。本项目源于我们对推定和验证的蛋白质伙伴的鉴定，这些伙伴暗示了 DUX4/DUX4c 蛋白在肌原纤维组织和 mRNA 翻译控制方面具有意想不到的细胞质功能。此外，除了 DUX4c 在成肌细胞中的内源性核定位外，我们还发现该蛋白在成肌细胞分化的特定时期存在胞质定位。我们还观察到 DUX4 在过表达后，在肌母细胞分化过程中发生胞质转位。由于DUX4和DUX4c的许多识别伙伴是相同的，FSHD肌肉细胞中DUX4/DUX4c蛋白的病理性增加可能会滴出一些伙伴，干扰DUX4c在肌肉中的正常功能，并有助于解释为什么该组织对病理性DUX4表达特别敏感（FSH协会2015年研究重点之一）。为了进一步研究这些观察结果，我们将：（1）使用荧光配体标记以HaloTag融合蛋白表达的DUX4/DUX4c，并使用不同的核输出/输入抑制剂，监测活肌肉细胞中DUX4/DUX4c蛋白的贩运（延时显微镜）；（2）生产更多特异性靶向DUX4c的抗体；（3）使用原位近端连接试验验证DUX4/DUX4c与在肌原纤维组织或mRNA翻译中发挥主要作用的伙伴的相互作用；(5）利用 DUX4/DUX4c 特异或缺失突变体和 HaloTag pull down，绘制与验证伙伴相互作用的特定 DUX4/DUX4c 肽结构域图；后者将用于筛选具有绘制的相互作用结构域的噬菌体展示文库，以筛选出能抑制或减少参与毒性通路的伙伴与 DUX4/DUX4c 相互作用的肽。然后，将在 FSHD 肌肉细胞培养物中引入阻断肽，并分析由此产生的表型，以评估 DUX 伙伴相互作用的生物学意义。通过阻断 DUX4/DUX4c 的毒性功能，这种方法可能对 FSHD 有治疗意义。我们希望该项目将有助于：(i) 界定 DUX4 和研究较少的 DUX4c 的新功能；(ii) 发现它们通过共享伙伴进行的假定相互作用；(iii) 为 FSHD 肌肉中 DUX4 的毒性机制带来新的启示；(iv) 提出防止蛋白质/蛋白质相互作用的新治疗策略。.

应 FSH 协会的要求，NDRI 建议开发和实施一项资源，以回收手术和死后人体生物样本，并将其分发给经批准的研究人员。该资源将利用 NDRI 的经验、专业知识和既有系统，扩大和提高 FSH 研究界可获得的人体组织的类型、数量和质量。建议 NDRI 的私人捐赠者计划与 FSH 合作，从参与 FSH 注册并同意回收组织和器官用于研究的患者处回收和分发组织。除了提供在死后和从外科手术中回收组织所需的所有资源外，NDRI 还将向 FSH 协会提供信息资料，以分发给潜在的登记册参与者，并提供经 IRB 批准的模板，以获得患者的知情同意和家属决策者的捐赠授权。.

序列特异性核酸酶可在确定的序列上切割 DNA 分子。如果序列特异性核酸酶是针对特定位点（例如 FSHD 基因座）设计的，科学家们就可以在该位点上进行设计的改变。Kyba 实验室一直在使用两种类型的序列特异性核酸酶，即锌指核酸酶和 TALENs，但最近又出现了一种新技术，即 CRISPR/Cas9。这项技术可以更快地开发和测试基因组编辑方法。这项基金允许实验室将这项新技术应用于基因组编辑项目。该基金有 3 个总体目标：1.他们特别计划使用 CRISPR/Cas9 来修改 “致病多聚 A 序列”，即位于 D4Z4 重复序列远端的 FSHD 致病序列。他们将用于这些研究的细胞是来自FSHD供体的人类诱导多能细胞。这些细胞来自成人捐献者，经过重编程后，其行为与胚胎细胞相似，具有无限增殖和分化潜能，因此一旦经过基因校正，它们应该能够生成缺乏FSHD突变的肌肉干细胞。2.这笔资金还将使实验室能够对携带FSHD突变的胚胎干细胞进行基因组编辑。3.3. 实验室将利用该技术对第4号染色体上FSHD基因座的DNA包装方式进行定义改变，以测试FSHD的分子机制模型。这些研究正在快速进行，有望为治疗方法的开发提供新思路。更多详情，请参阅 2013 年 8 月的奖项。.

D4Z4区域的表观遗传变化导致的DUX4基因转录抑制被认为是导致前列腺增生症的原因。在初步研究中，我们发现聚（ADP-核糖）聚合酶1（PARP1）与DUX4基因的启动子相互作用。有趣的是，只有在前列腺肥大症肌母细胞中才能观察到这种相互作用，而在对照细胞中却观察不到，这表明这种相互作用可能是前列腺肥大症发病机制的一部分。PARP1是一种核蛋白，在多种细胞过程中发挥作用，并在调控基因表达方面发挥关键作用。多项研究表明，在靶基因的启动子上，PARP1 与 DNA 甲基转移酶 1（DNMT1）结合，并通过多聚 ADP 核糖基化抑制其功能。因此，由于启动子区域的低甲基化，靶基因的表达受到抑制。有趣的是，我们在初步研究中发现 DNMT1 共同定位在 DUX4 启动子区域。此外，用 PARP1 抑制剂处理的 FSHD 肌母细胞显示出 DUX4 表达的标记物 ZSCAN4 的表达减少。根据现有知识和我们的初步数据，我们推测 PARP1、DNMT1 和 DUX4 启动子之间的相互作用导致了该区域的 DNA 低甲基化，并可能进一步影响 FSHD 肌母细胞中 DUX4 的表达。本研究的目的是测试一种合成 PARP1 抑制剂和一种膳食 PARP1 抑制剂对 DUX4 表达的影响，并进一步研究 PARP1 和 DNMT1 在 FSHD 中的参与情况。在目的 1 中，我们将确定 PARP1 抑制剂对 FSHD 肌母细胞 DUX4 表达和细胞表型的影响。目的 2 中，我们将确定 DNMT1 是否直接与 FSHD 肌母细胞中的 DUX4 启动子区域相互作用。目的 3 中，我们将确定 PARP1 是否是 DUX4 的直接调控靶标。研究结果将有助于深入了解 PARP1 在 FSHD 中的参与情况，并对目前尚无有效治疗方法的 FSHD 的疗法开发产生直接影响。.

面肩胛肱肌营养不良症（FSHD）是最常见的肌营养不良症之一，目前已确定了该病的两个基因位点。第一个基因位点位于 4 号染色体的亚群区域，在 95% 的 FSHD 患者中发生突变（命名为 FSHD1）。该区域由一个名为 D4Z4 的 3.3 kb 串联重复序列组成。在普通人群中，重复序列的数量从 11 个到 150 个不等，而 FSHD1 患者则只有 1 到 10 个重复序列。第二个序列位于 18 号染色体，在发现 SMCHD1 基因突变的 FSHD 患者中，有 5% 基因发生了突变。尽管疾病的遗传起源不同，但所有患者在表型上没有区别，并具有共同的分子特征，其中包括一种名为 DUX4 的蛋白质的表达。DUX4 是一种转录因子，编码一种潜在的同源框蛋白，过量表达后会误导 500 多个基因，从而产生剧毒。每个 D4Z4 单元中都有 DUX4 ORF，但只有最端粒化的单元才有可能产生 DUX4 mRNA，因为 D4Z4 阵列下游的 4qA 序列会诱导 DUX4 mRNA 增加聚（A）尾，从而使 DUX4 mRNA 趋于稳定。由于DUX4是FSHD1和2患者的共同致病靶点，我们的目标是利用转录激活剂样效应核酸酶（TALEN）和CRISPR/Cas9技术进行基因编辑，以修改FSHD基因座并永久抑制DUX4的表达。我们选择开发两种策略：(i) 删除整个 D4Z4 阵列，因为存在这种缺失的个体不会出现肌肉病变；(ii) 突变 DUX4 多聚（A）信号，因为已有研究表明，该多聚（A）序列中的单点突变足以通过改变其稳定性来抑制 DUX4 mRNA 的表达。具体目标将包括(i) 设计具有最佳活性和序列特异性的核酸酶，并优化基因组工程策略 (ii) 挑选携带 D4Z4 和 4qA 序列修饰的 FSHD 细胞，以抑制 DUX4 (iii) 在适当的细胞培养和动物模型中测试 D4Z4 基因组工程的治疗效果，具体做法是进行多种表型测量，以评估 D4Z4 阵列靶向突变对 FSHD 特征的影响。与目前正在研究的其他FSHD治疗策略相比，我们提出的方法有很多优势。由于基因组编辑可以在被修饰细胞及其后代的整个生命周期内通过短暂的核酸酶活性实现永久性矫正，因此不需要反复长期用药治疗。从成本、毒理学和免疫学风险的角度来看，这种临床疗法的优势显而易见。此外，这种方法适用于所有前列腺增生症病例，无论涉及的是哪种确切的突变/牵连。.

DUX4已被确定为前列腺增生症的潜在致病因子，但DUX4导致前列腺增生症病变的机制尚不清楚。我们的核心假设是，DUX4 转录因子参与了蛋白质与蛋白质之间的相互作用，这种相互作用影响了其诱导肌肉细胞毒性的能力，并最终导致了前列腺增生症。DUX4 N端的两个同源结构域使其能够结合DNA的特定序列。DUX4 转录激活结构域的 C 端残基 160-424 是诱导肌肉毒性的关键，但 C 端结构域介导 DUX4 活性的机制尚不清楚。我们认为，DUX4 C 端结构域参与了影响其转录正常基因和毒性基因能力的蛋白质招募。我们的初步数据确定了几种候选的 DUX4 相互作用蛋白。我们建议的研究目标是确定 DUX4 与其候选结合伙伴之间的关键相互作用，我们可以针对这些相互作用进行治疗，以消除 DUX4 在 FSHD 肌肉中的毒性作用。我们提出的目标将确定 DUX4 蛋白结合伙伴和机制，并阐明蛋白质之间的相互作用对 DUX4 相关致病级联的影响。我们计划通过以下两个具体目标来验证我们的假设：具体目标 1：确定 DUX4 C 端结构域的结合伙伴和蛋白-蛋白相互作用机制。具体目标 2：研究对 DUX4 毒性至关重要的 DUX4 蛋白-蛋白相互作用的功能意义。.

最近发现的 DNA 结合因子，其序列特异性由识别单碱基的模块化结构域（TALENs）或引导 RNA（CRISPRs）编码，为基因组编辑带来了巨大的新可能性。在一项为期两年的 ARRA 基金的早期支持下，以及现在美国国立卫生研究院 R01 的持续支持下，我们开发出了一种针对 4q35.2 的锌指核酸酶 (ZFN)。我们利用这一工具在 FSHD iPS 细胞中的这一位置引入了一个新的端粒，从而有效地消除了基因病变。一个等位基因上缺少 4qter 的个体是正常的，而我们的靶向 iPS 细胞失去了 D4Z4 的收缩元件，也同样是正常的。这种改造使细胞不再表达 DUX4 mRNA，纠正了我们在 FSHD iPS 细胞中发现的分化缺陷。我们向FSH协会寻求资助，以扩大这一研究计划：（1）将FSHD人类胚胎干细胞纳入其中（我们的美国国立卫生研究院基金支持FSHD iPS细胞）；（2）将CRISPR技术引入令人兴奋的新领域，对致病的4qA161等位基因进行更特异的基因还原；以及（3）测试通过工程序列特异性染色质核因子靶向D4Z4可引入表观遗传沉默的假设。目标 1.在携带 FSHD 基因突变的人类胚胎干细胞中校正 FSHD 基因座。我们迄今为止的工作表明，FSHD iPS 细胞表达 DUX4 mRNA，并对 Pax7 诱导的骨骼肌分化反应受损，而通过基因移除收缩的 D4Z4 阵列可恢复这些表型。这些 iPS 细胞来源于肌母细胞，因此这些表型是否代表前 iPS 细胞类型的表观遗传记忆还存在一些疑问。因此，在FSHD人类胚胎干细胞中进行这种遗传校正至关重要。目标 2.设计针对 4q35.2 现有位点和新位点的 CRISPRs。使用我们的 ZNF 试剂进行靶向整合的效率较低，因此我们将测试 CRISPER 技术能否提高现有基因修复方法的效率。我们还将设计和测试以致病多聚 A 信号为靶点的 CRISPER，这样可以在不消除整个 D4Z4 阵列的情况下校正基因位点。目标 3.使用工程序列特异性 DNA 结合工具将染色质成核复合物靶向 D4Z4。虽然人们对 TALENs 和 CRISPRs 的热情主要集中在它们靶向核酸酶在 DNA 中引入双链断裂的能力上，但它们也可用于将其他蛋白质靶向 DNA。由于FSHD是由挛缩等位基因上的D4Z4染色质不适当松弛引起的，我们将尝试通过把工程化的D4Z4特异性DNA结合域与参与异染色质成核的蛋白质融合，在该位点重建异染色质。这些研究利用并发挥了现有的FSHD iPS细胞基因组编辑研究计划的优势，将为研究FSHD的发病机制以及开发基于校正、同源iPS细胞的细胞疗法提供宝贵的新工具。Kyba博士的项目由学会与阿尔伯塔省卡尔加里市加拿大FSHD基金会合作共同资助。.

面岬肱肌营养不良症（FSHD）是第三种最常见的肌肉营养不良症，在过去几年中，对该病的大部分研究工作都集中在确定由致病性 D4Z4 重复收缩激活的非常规遗传机制的特征上。在我们的研究中，我们将使用高截留膜微透析技术，这是一种从未应用于骨骼肌研究的技术，目的是阐明遗传病变下游的致病机制，尤其侧重于尚未明确的炎症方面。从将临床成像信息与分子数据相结合的转化研究的角度出发，我们将对 FSHD 患者在疾病早期阶段受影响肌肉的微环境（肌肉 MRI 上的 STIR 高信号和 T1 加权正常信号，即肌肉出现水肿变化但尚未或仅部分被脂肪组织取代）与明显未受影响肌肉的微环境（肌肉 MRI 上的正常 T1 加权和 STIR 信号）进行比较。将使用 xMAP 技术（多分析物谱分析珠）分析肌肉微量血样，以比较两种情况下的炎症细胞因子、趋化因子和生长因子水平，并确定炎症模式和相关介质的特征。这将有助于更好地了解炎症过程在疾病中的作用，确定单个肌肉水平的疾病活动生物标志物，并最终获得有助于开发靶向抗炎疗法的信息。未来，高截止肌肉微透析方案可用于神经肌肉疾病的分子监测和最终用药。.

面颊肱肌营养不良症（FSHD）是全球第三大常见肌营养不良症，但其发病率可能被低估了，它是欧洲最常见的肌营养不良症。FSHD是一种成人发病的常染色体显性遗传疾病，以面部肌肉和上半身肌肉萎缩为特征。疾病可发展到影响下肢肌肉，严重影响生活质量。95%以上的FSHD病例是由第4号染色体次同源区的D4Z4微卫星重复序列收缩引起的。在未受影响的个体中，D4Z4重复区域由11-100个D4Z4单位组成，但在前列腺增生症患者中，这一数量减少到不足11个。但至少需要一个 D4Z4 单元才能导致前列腺增生症，而且只有在与 4 号染色体远端（4qA161）上的特定多态性同时遗传时才能导致前列腺增生症。每个 D4Z4 单元都包含一个双同工酶 4（DUX4）基因的开放阅读框，4qA161 多态性为最后一个 D4Z4 单元产生的 DUX4 转录本提供了一个多腺苷酸化信号。这种允许的染色体配置产生了稳定的 DUX4 转录本，FSHD 很可能是由 DUX4 水平升高的毒性功能增益引起的。人们对 DUX4 的功能知之甚少，现在的挑战是阐明 DUX4 水平升高是如何导致肌肉萎缩症的。DUX4 是一种假定的转录因子；其 N 端包含两个同源结构域，与转录因子 PAX7 的同源结构域高度相似，C 端是转录的激活因子。DUX4 可诱导细胞凋亡，而较低的表达水平会降低 MyoD，影响成肌细胞的功能和分化：这一点很重要，因为 FSHD 会损害成肌细胞和肌管的形成。针对 FSHD 和其他肌肉萎缩症进行了许多基因表达研究，但这些研究尚未通过最新的生物信息学技术进行彻底分析。为了解决这个问题，我们开发了一种新的差异网络方法，旨在从此类表达数据中识别疾病网络中受干扰的信号通路。利用这种新型数学方法，我们对来自 FSHD 肌肉活检的多个公开基因表达数据集进行了荟萃分析。然后，我们在对适当的数据集进行荟萃分析后，剔除了与肌肉萎缩、衰老、萎缩和炎症相关的变化。这一综合结果是一个解释 FSHD 病理机制的高可信度统一通路变化网络。对我们网络的研究发现了许多有前景的药物靶点和候选疗法。在此，我们希望扩展并完善这一分析，以确定 FSHD 网络中导致肌肉修复和再生受损的通路。为此，我们将通过 RNA-seq 技术收集和分析 FSHD 肌肉分化过程中全基因组基因表达的高频时间过程。在此基因表达数据集上使用数学方法和优化的网络理论工具，将揭示 FSHD 肌生成的分子机制。我们还将对异位表达 DUX4 的成肌细胞进行高频时程 RNA 序列分析，以确定 DUX4 转录介导的主要基因表达变化。这将使我们的前列腺增生症网络能够确定前列腺增生症的因果信号事件，进一步消除对肌肉萎缩、炎症、废用症等的非特异性一般适应。它还将更好地确定网络中与 DUX4 直接相关的通路。这些结果将共同确定关键的通路靶点，对这些靶点的改造将有助于恢复前列腺肥大症患者的肌肉再生，扭转肌肉无力和萎缩。我们的最终目标是获得有关前列腺肥大症肌肉生成的知识，为设计前列腺肥大症的疗法提供依据。我们有四个目标：1.首次获得 FSHD 和对照组人类肌母细胞成肌分化过程中全基因组基因表达的高频时间过程。2.2. 在表达异位 DUX4 的成肌细胞中获得全基因组基因表达的高频时间序列。3.应用我们的数学方法和优化的网络理论工具分析生成的时间历程基因表达数据集。4.4. 验证筛选出的靶点，作为治疗前列腺增生症的潜在疗法进行快速转化研究。.

前列腺增生症协会让我们能够将工作重点扩展到一种测量肌肉结构的新技术上。电阻抗肌电图（EIM）是一种快速、无创的方法，可以获得肌肉结构的定量信息，这些信息可能与前列腺肥大症患者的运动强度和功能相关。该设备由 Convergence Medical Devices 公司（图 1，马萨诸塞州波士顿市）制造，利用肌肉结构与流经肌肉的电流阻抗之间的关系，通过低强度电流来获取有关肌肉结构的信息。EIM 非常适合用于研究对前列腺增生症很重要、但不易用传统力量测量方法测试的肌肉，包括面部、腹部和脊柱旁肌肉。前列腺增生症协会的资助让这样的项目成为可能。任何项目最难的部分就是获得资金来启动项目：FSH 协会的资助让我们能够开始招募参与者来测试这些结果，并让我们能够向美国国立卫生研究院等机构申请额外资金来完成这个项目。对于前列腺增生症研究界来说，在分子病理生理学和药物开发领域取得进步的同时，成果测量方法的开发也至关重要。本项目完成后，我们有望为未来的临床试验提供三种有价值的 FSHD 相关新结果测量指标。.

该项目的目标是为前列腺肥大症制定准确、可靠的诊断方法。据报道，前列腺增生症的发病率为两万分之一，但由于未确诊病例（发病率可能为1/7,000），实际患病人数远高于此，这一点备受关注。大多数前列腺肥大症病例涉及 4q 染色体次同源区大卫星 D4Z4 重复序列的单等位基因缺失（4qter D4Z4）（FSHD1），而其余小于 5% 的病例则没有 D4Z4 重复序列收缩（FSHD2）。正确的诊断首先取决于对临床症状和体征的识别，并将 FSHD 病例与其他肌肉萎缩症区分开来。分子研究可用于加强临床印象。主要方法是通过脉冲场凝胶电泳（PFGE）检测4qD4Z4重复收缩。但是，这种方法不能确定表型 FSHD2，而且某些条带模式可能难以解释。因此，我们迫切需要一种更好的诊断技术。横森研究小组之前发现，在FSHD1和FSHD2患者细胞中都能检测到D4Z4重复序列上组蛋白修饰的特异性变化（组蛋白H3赖氨酸9三甲基化（H3K9me3））。重要的是，这种变化对 FSHD 具有高度特异性，在血液样本的患者细胞中也能看到。因此，在本项目中，我们计划测试将检测患者染色质中 H3K9me3 的缺失作为 FSHD 诊断方法的可能性。我们计划使用患者血液样本中的外周血单核细胞（PBMC）。H3K9me3 丢失的检测将通过生化方法（染色质免疫沉淀 (ChIP)）进行评估。我们将通过检测健康人、不同年龄和疾病严重程度的患者以及患有无关肌营养不良症或无关疾病的人的血液样本来评估我们方案的特异性。之前的相关资助：FSHD 的表观遗传异常 研究人员：曾伟华博士加州大学欧文分校曾伟华博士和横森京子博士。自 2011 年 2 月起：$8,875，延长三个月。.

D4Z4重复阵列染色质松弛和非多聚腺苷酸化双同源物4（DUX4）基因的转录去抑制统一了D4Z4收缩依赖性FSHD1和收缩非依赖性FSHD2。只有在 FSHD 允许的遗传背景下，来自阵列最端粒单位的 DUX4 转录本才能通过阵列外的多聚腺苷酸（polyA）信号稳定下来。在缺乏这种 polyA 信号的情况下，非允许性染色体无法稳定 DUX4。FSHD1和FSHD2中体细胞DUX4的抑制导致培养的FSHD肌管零星细胞核中的DUX4蛋白爆发。DUX4在生殖系中高表达。它在胚胎干细胞中低表达，随后在分化过程中沉默。FSHD iPS细胞在分化过程中不能沉默DUX4。DUX4在肌肉中的调控机制在很大程度上是未知的，目前我们还不知道一种微量表达的蛋白质是如何导致慢性和进行性肌肉萎缩的。虽然其他人使用传统的过表达载体来研究 DUX4 的影响，但我们一直观察到，使用保留了 DUX4 基因组组织的构建体，即在 D4Z4 的背景下，该基因座会产生 DUX4 的零星表达爆发：不仅在 FSHD1 和 FSHD2 培养的肌肉细胞中，而且在我们的转基因 L42 小鼠培养的肌肉细胞中，以及在稳定转染了基因组 D4Z4 构建体的 C2C12 细胞中。这些突变在增殖细胞中发生频率较低，在分化过程中发生频率增加。我的目标是找出调控 DUX4 活性爆发的表观遗传学机制。我将开发报告基因构建体，其中 D4Z4 中的 DUX4 ORF 被报告基因取代，但远端 DUX4 基因的基因组完整性得以保留。这些报告基因将用于以下实验：1.荧光报告基因构建体将用于生命细胞成像研究，以精确描述表达爆发的特征。虽然 DUX4 的最高体细胞表达是在分化的肌管中观察到的，但在增殖过程中也能偶尔观察到表达 DUX4 的细胞核。生命细胞实验将确定 DUX4 的爆发是否依赖于细胞周期，或者是否有其他因素调节 DUX4 的表达。它还将确定单个细胞核是否能重复表达 DUX4，或者这是否是一次性事件。2.2. 在构建体中插入荧光报告基因，可通过 FACS 分选分离表达的肌肉细胞，并通过 ChIP 与组蛋白修饰面板比较表达和非表达细胞的染色质结构，从而识别哺乳动物细胞的主要染色质状态。这些染色质研究将在我们广泛收集的 FSHD 患者和对照组的原代肌肉细胞中进行验证。我希望这项研究能在表达和不表达 DUX4 的细胞中绘制出 FSHD 基因座的综合表观遗传图谱。3.3. 该报告构建体还将用于专用和大规模筛选激活或抑制 DUX4 的化合物。我将利用已建立的 RNA 干扰（RNAi）筛选（与阿姆斯特丹 NKI 的 Agami 博士合作）来确定影响 D4Z4 染色质结构的染色质修饰物。我将在 FSHD 患者和对照组的原代肌肉细胞中验证这些研究。我希望这项研究能为FSHD患者和对照组基因座的染色质结构提供机理上的见解。目前，我们已经确定了 FSHD 的统一分子机制。我希望这项研究能填补我们目前在微量表达的蛋白质如何导致渐进性肌肉疾病模型方面的空白。FSH Society Marjorie Bronfman 研究基金 FSHS-MGBF-019 FSHS-82011-01。.

面肩胛肱肌营养不良症（FSHD）是人类最常见的遗传性进行性肌肉疾病。它是一种常染色体显性遗传病，会导致患者多处肌肉萎缩和无力（最初为面部、肩部和上臂，后期为腿部），并造成严重残疾。近年来，人们在了解前列腺肥大症的病理生理学方面取得了进展，从而确定了治疗目标。然而，我们还缺乏适当的生物标志物来反映这些患者的肌肉退化和再生程度。要成功完成临床试验，就必须要有这样的生物标志物。拟议中的研究将验证以下假设：质子磁共振波谱（MRS）和定量磁共振成像（MRI）可用于确定前列腺肥大症患者和肌肉正常的对照组骨骼肌中独特的代谢特征。然后，这些特征可用作疾病严重程度的生物标志物和前列腺增生症治疗临床试验的替代结果指标。该项目的最初目的是在前列腺肥大症患者的骨骼肌中建立定量 MRS 模式。为了实现这一目标，我们将对 30 名经基因证实患有 FSHD 并可测量到二头肌无力的受试者进行横断面成像研究。每位受试者都将接受上肢 MRI/MRS 成像检查，我们将把肱二头肌的代谢特征与疾病严重程度（通过定量肌肉测试测量）联系起来。我们还将制定进一步的具体目标，以便1）将患有前列腺肥大症的受试者的磁共振波谱特征与健康组和疾病对照组进行比较；2）确定磁共振波谱生物标志物与从肌肉活检样本中收集的分子生物标志物之间的相关性；3）在重复研究中观察肌肉波谱的纵向变化。拟议项目的综合成果将是一个可用于未来 FSHD 临床试验的成像方案。FSH Society Irene Lai 研究基金 FSHS-SLMM-002 FSHS-82011-02。.

这项每年 $12,500 美元的资助是对美国国立卫生研究院 R21 1R21NS076671-01（为期 2 年）申请的补充支持，该申请旨在确定 DUX4 的化学抑制剂。我们之前筛选了 20 万种化合物，确定了约 600 种 DUX4 诱导细胞死亡的抑制剂，目前的工作旨在确定这 600 种抑制剂中最有前景的线索。美国国立卫生研究院（NIH）的资助申请最近被选中，并已开始拨款。FSH协会提供的这笔资助将用于补充美国国立卫生研究院的项目，主要是提供额外的药物化学支持（使我们能够通过购买/合成增加后续化合物的数量。这些化合物有助于我们了解可间接抑制与 DUX4 相关的毒性的途径。有关 R21 的更多信息，请参见 1R21NS076671-01 [ http://projectreporter.nih.gov/project_info_description.cfm?aid=8225734&icde=10980193 ]。.

前列腺增生症是一种肌肉变性疾病，遗传上与 4q35 亚群聚区 D4Z4 重复序列的收缩有关。我们的研究小组在 D4Z4 重复序列的每个单元中都鉴定出了双同源染色体 4（DUX4）基因，并证明在 FSHD 患者的原发性肌母细胞和活检组织中表达了编码蛋白，而在未受影响的个体中则没有表达。我们发现，唯一稳定的 DUX4 信使 RNA 来自最后一个单元，并延伸到提供 polyA 加成信号的侧翼 pLAM 序列。八家实验室联盟对数百名患者和数千名健康人的基因多态性进行了研究，并独立证实了前列腺增生症的发病需要这种信号。我们与四个不同研究小组的合作研究结果表明，DUX4 蛋白是一种转录因子，它以大量基因为靶标，其中一些基因编码其他转录因子，这些转录因子又以其他基因为靶标。在全球范围内，FSHD基因座上的DUX4激活会启动一个转录级联，导致肌肉萎缩、炎症、分化潜能下降和氧化应激，这些都是该疾病的主要特征。通过对蛋白质、核糖核酸和基因的差异研究，我们不断发现更多的 FSHD 生物标志物，并确定它们是 DUX4 的直接还是间接靶标。令人震惊的是，我们发现 DUX4 在人类肌母细胞中的表达会诱导萎缩性肌管表型和萎缩标志物。我们正在进行的项目的基本原理是，抑制 DUX4 的表达应能阻止全局基因失调过程，使患者的肌肉再生。我们首先开发了小抑制 RNA（siRNA）和条件，以抑制转染有 DUX4 表达载体的原代肌母细胞或原代 FSHD 肌母细胞中 DUX4 蛋白的表达。在FSHD肌母细胞中加入DUX4 siRNA后，肌管表型恢复正常，萎缩标志物减少。由于 Steve Wilton 教授（澳大利亚 ANRI）在杜氏肌营养不良症的反义寡核苷酸（AOs）外显子跳越治疗方法方面的专业知识，我们与他开始了合作。威尔顿教授为我们提供了 7 种针对我们研究小组鉴定的 DUX4 mRNA 不同部分的 AO：目的是阻断翻译或诱导 mRNA 降解，从而阻止 DUX4 蛋白的表达。在人类原代成肌细胞培养中，我们确定了 3 种 AO 选择性抑制 DUX4 的条件，与上述 siRNA 相同。此外，抑制 DUX4 mRNA 还会影响几个 FSHD 标志物的表达，如 μ-结晶素、β-catenin 和 TP53。这些结果在成肌细胞培养中证明了抑制 DUX4 可逆转 FSHD 表型的概念。在本项目中，我们希望通过其他技术（RNA 和蛋白质表达谱分析）验证这些结果，并在小鼠体内模型中测试这些 AOs 和 siRNA 的效果。一项FSH Society New York Festive Evening of Music and Song奖学金。.

前列腺增生症的基因病因是位于4号染色体4q35上的D4Z4 DNA重复序列收缩。虽然这种基因缺陷早在20年前就已被发现，但导致该病的确切分子机制尚不清楚，目前也没有小鼠疾病模型。为了提供这样一种有价值的工具，我们将通过将FSHD患者衍生的肌母细胞移植到小鼠肌肉中，建立一个人源化的FSHD小鼠模型。移植的人体细胞能够在宿主小鼠肌肉中形成肌纤维，因此可以在体内进行开创性的研究。由于前列腺增生症具有显性特征，我们假设移植的肌纤维将显示疾病表型，并再现与前列腺增生症相关的病理分子机制，从而使我们能够研究该疾病的发展。我们的初步研究已经确定了该项目的可行性。通过波士顿生物医学研究所（BBRI）韦尔斯通中心（Wellstone Center）的细胞库，我们有独特的机会从FSHD疑似患者及其适当的对照组（即直系亲属）中获得早期的成肌细胞。我们将把这些标准化培养的细胞移植到小鼠肌肉中，以获得 FSHD 人源化小鼠模型，从而为 FSHD 研究建立一个控制良好的体内模型。目前该领域亟待解决的问题是验证现有的 DUX4 模型。制作的人源化小鼠将用于研究 DUX4 基因表达是 FSHD 发病机制的主要原因这一假设。在获得的模型中，将在体内再生过程中评估 DUX4 的表达，并评估其表达对纤维周转和卫星细胞更新的影响。这项工作将有助于了解 DUX4 在体内的作用，从而更好地了解 FSHD 的发病机制。拟议项目将按照两个具体目标完成：具体目标 1：优化 FSHD 人源化小鼠模型。我们将通过设计更有效的移植策略来改进初步实验所取得的结果。为了全面解释该疾病模型，我们将通过设计更有效的移植策略，设法增加植入人体细胞形成的肌肉数量。BBRI 韦尔斯通中心的细胞库提供了新鲜分离的 FSHD 及其适当的对照肌肉细胞，这些细胞经过 CD56 表达分拣，预计具有特别高的移植潜力。不过，注射毒素和注射细胞之间的时间安排，以及通过照射小鼠腿部来消耗内源性卫星细胞，可能会影响植入细胞再生小鼠肌肉的能力，因此将在此过程中进行优化。在建立有效的小鼠模型后，我们将按照具体目标 2 的描述，寻找疾病特征。具体目标 2：确定 FSHD 人源化小鼠模型的特征，评估 DUX4 在体内肌肉再生过程中的作用。具体目标 1 中获得的模型将通过确定注射肌肉中 FSHD 细胞生成的纤维与适当对照细胞生成的纤维之间的差异来表征。该领域的最新突破表明，在 D4Z4 重复序列中发现的 DUX4 基因会在 FSHD 患者的肌肉中表达一种有毒蛋白质，从而导致疾病。DUX4可能在发育过程中发挥正常作用，而FSHD的病理可能涉及DUX4的不完全发育沉默。然而，涉及DUX4的确切分子和细胞机制仍有待揭示。目前，BBRI韦尔斯通中心正在研究其队列收集的肌肉样本中DUX4的表达情况，已经能够在FSHD样本中检测到DUX4转录本，这些队列将被选中用于生成人源化FSHD小鼠模型。首先，将在FSHD肌肉和对照组移植肌肉中评估DUX4在mRNA和/或蛋白质水平上的表达。随后，我们还将进行实验，比较移植肌肉纤维的生物学特性。最后，我们将开发一种动态方法来研究当前的 DUX4 模型，利用体内生物发光实时成像技术跟踪移植纤维随时间的演变。由于小鼠模型能够再现复杂的体内环境，因此超越了体外模型的局限性，从而提供了对疾病机制的更深入了解。我们在小鼠肌肉中创建人源化 FSHD 纤维的模型将再现病理纤维在体内形成的机制，使我们能够全面了解疾病进展的特征，并测试潜在的治疗药物。纽约前列腺增生症协会音乐与歌曲节庆晚会研究金。.

FSHD被认为是成人中最常见的遗传性肌肉疾病，每2万人中就有一人患病。它与 4q35 亚群聚区的 D4Z4 重复序列收缩有关。在未受影响的个体中，该阵列由 3.3-kb D4Z4 元素的 11-100 个串联拷贝组成，而在患者中，只剩下 1-10 个 D4Z4 拷贝（Wijmenga 等人，1992 年）。我们的研究小组在 D4Z4 重复序列的每个单元中都发现了双同源染色体 4（DUX4）基因（Gabriels 等人，1999 年），目前已有多项研究证明 DUX4 在 FSHD 中的致病作用。我们已经证明，稳定的全长 DUX4 信使 RNA（mRNA）是由 FSHD 最后一个 D4Z4 单元产生的，使用的是位于远端重复序列端粒的侧翼 pLAM 区域中的多聚腺苷酸化信号（Dixit 等人，2007 年），最近对数百名患者和数千名非患者的基因多态性研究也证实了这一点（Lemmers 等人，2010 年）。这个多聚腺苷酸化位点是FSHD在一个收缩等位基因上发病所必需的，因此被称为 “允许染色体”（Lemmers等人，2010年）。这个远端 D4Z4 单元的 mRNA 包含整个 DUX4 开放阅读框（ORF）和 3’UTR 中的 1 或 2 个替代剪接内含子（DUX4-fl）。此外，短的 DUX4 mRNA 终止于 pLAM 区域中先前描述的多腺苷酸化位点，但使用了 DUX4 ORF 中的一个隐性剪接供体位点（DUX4-s）。DUX4-fl只在FSHD肌肉细胞和活组织切片中检测到，而DUX4-s在对照组和一些FSHD样本中都能检测到（Snider等人，2010年）。在诱导多能干细胞（iPS细胞）和人类睾丸中检测到一种长的DUX4 mRNA，该基因含有4个额外的外显子和一个更远的多聚腺苷酸化信号。这种DUX4 mRNA的表达在对照iPS细胞分化为胚状体的过程中受到抑制，而全长DUX4 mRNA的表达在分化的FSHD iPS细胞中持续存在（Snider等人，2010年）。这些数据以及 DUX4 ORF 在进化过程中的保留（Clapp 等人，2007 年）表明，DUX4 可能在人类发育过程中发挥作用。Tassin 博士打算于 2011 年在伦敦国王学院（King's College London）担任为期三个月的博士后，启动我们实验室与 P. Zammit 博士实验室之间的合作研究项目。根据与 Zammit 博士达成的协议，我们的合作项目将包括测试我们实验室与 S. Wilton 教授（西澳大利亚大学 ANRI）合作开发的针对 DUX4 基因 3’UTR 的反义寡核苷酸 (AOs)。这些 AO 已在细胞培养中进行了初步筛选，但还需要进行更广泛的测试。扎米特博士开发的小鼠肌纤维模型为进一步测试我们的 AOs 提供了理想的系统。我们将用编码 DUX4 的逆转录病毒载体感染与分离出的肌纤维相关的卫星细胞，并分析施用 AO 对肌生成进展和细胞凋亡的影响。我们希望特别关注导致 FSHD 的 DUX4 mRNA 稳定的 pLAM 区域。通过这一系统，我们可以更好地了解 AO 的作用，从而评估其作为人类疗法的潜在适用性。我们相信，这次合作将为我们提供治疗前列腺增生症的新方法。获得 FSH 协会加利福尼亚州 "行走和滚动 "研究金资助。.

前列腺增生症亟需一种有效的小鼠模型。这种动物模型将为探索新克隆基因和新型蛋白质对该疾病病理生理学的影响提供宝贵的工具。它还将极大地促进FSHD新疗法的开发和测试研究。我们建议研究两种可能的FSHD小鼠模型，即Davide Gabellini博士和Rossella Tupler博士的FRG1过度表达基因模型，以及Patrick Reed博士和Robert Bloch博士开发的μ结晶素过度表达基因模型。我将培育这些小鼠，并测试它们的生理和形态特征、对损伤的易感性以及从损伤中恢复的能力。我还将启动异种移植研究，结合布洛赫实验室的常规方法和韦尔斯通肌肉萎缩症合作研究中心（MDCRC）“FSHD治疗生物标志物 ”合作者提供的独特试剂，创造出具有人源化正常和FSHD踝背肌的小鼠。这些实验将揭示现有转基因模型在研究前列腺增生症方面的实用性，并促进人源化小鼠肌肉的发展，以便在原位研究前列腺增生症的病理生理学。纽约前列腺增生症协会 "音乐与歌曲之夜 "奖学金。.

我们的初步研究结果表明，D4Z4重复区域确实与其他基因组区域发生了相互作用，而且这些相互作用在前列腺肥大症中确实被破坏了。在我的研究金延长三个月后，我计划利用最近开发的 “成对末端标记染色质相互作用分析”（ChIA-PET）技术，对与D4Z4相互作用的潜在靶基因进行高通量鉴定。这种策略能够在全基因组范围内检测由通常在D4Z4处组装的特定因子介导的染色质相互作用。除FRG1和DUX4外，鉴定FSHD的其他致病基因对于探索未来的治疗靶点以改善或预防FSHD的临床症状非常重要。此前，在2010年FSH协会的支持下，我们发现在FSHD细胞中，一组通常聚集在D4Z4重复序列上的因子并不与这些重复序列结合。有趣的是，这些因子已知具有基因沉默和长距离基因组相互作用的功能，而这似乎对人类细胞中的协调发育基因调控尤为重要。目前已发现两个候选基因，一个是邻近区域的 FRG1，另一个是 D4Z4 内编码的 DUX4，它们的人工过度表达分别导致了体内肌肉萎缩症或体外成肌细胞分化缺陷。与 D4Z4 基因沉默相关的染色质结构缺失可能解释了这些基因在该疾病中的异常表达。然而，FSHD 患者的肌肉细胞并不总是过度表达这些基因。因此，FSHD的发病机制可能还涉及其他未确定的基因和信号通路。我们的假设是，D4Z4通常通过与D4Z4结合的因子介导的基因组相互作用，对目标基因产生沉默效应。前列腺增生症患者丧失了这一功能，导致一组靶基因异常过度表达，从而引发该疾病的临床表现。我正在采取两种策略来检验这一模型：（1）通过高通量全基因组染色质免疫沉淀（ChIP）测序筛选任何可能丢失与D4Z4在FSHD中丢失的因子类似的因子的基因；（2）使用生化染色质构象捕获（3C）相关方法直接搜索与D4Z4相互作用的基因组区域。通过这些检测方法确定的候选基因将被检测其对细胞活力、增殖/分化以及肌肉相关下游基因表达的影响。我将尝试在正常人肌母细胞中重新创建 FSHD 细胞中检测到的表达变化（过度表达或抑制），并将其与 FSHD 肌母细胞的表型进行比较，以确定候选基因是否有助于 FSHD 细胞表型的形成。我的研究旨在破译前列腺增生症的表观遗传学异常机制，这将为疾病机制提供新的见解，从而有可能提出新的治疗策略。FSH Society Sanford Batkin & Helen Younger 和 David Younger 研究奖学金资助。.

我们请求前列腺增生症协会支持我们的试点项目，调查未受影响和前列腺增生症受试者的 DUX4 表达情况。FSHD的DUX4-fl表达模型尚未得到独立验证，这可能是由于该领域缺乏高质量的临床资源。在FSHD研究的当前阶段，验证和扩展DUX4-细胞毒性发病机理模型对整个领域都至关重要，而我们最适合利用美国国立卫生研究院Wellstone肌肉萎缩症研究中心（NIH Wellstone Muscular Dystrophy CRC）为BBRI的FSHD研究提供的一套独特的高度可控试剂进行必要的实验。每个 Wellstone 队列由一名受 FSHD 影响的受试者和一名未受影响的一级亲属组成。每位受试者捐献两份活检样本，一份来自肱二头肌，一份来自三角肌。每份活检样本中都有一部分用于提取肌原细胞培养物。令人惊讶的是，在我们使用 4 个队列得出的初步结果中，我们发现了一些与已发表的 DUX4 表达结果不一致的地方，需要进一步调查。因此，我们开始了一项更大规模的工作，利用 RT-PCR 和免疫染色（ICC）技术分析 DUX4-fl mRNA 和蛋白质在更多 Wellstone 队列中的表达情况。但是，我的实验室和最初的韦尔斯通预算都没有为这个项目提供资金，我的实验室也没有从韦尔斯通中心获得任何资金支持。韦尔斯通中心为我们提供了细胞（由我们培养）和 RNA（由 Louis Kunkel 实验室从活体组织中纯化而来），我们很幸运地得到了这些韦尔斯通样本。目前，为了确保我们的结果在统计学上有意义，我们需要分析更多的细胞和活检 RNA，而这已经变得成本高昂。因此，我请求为进行这些实验所需的消耗品和服务（DNA 测序）提供资金支持。FSH Society Cape Cod Walk and Roll 研究金资助。.